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Immunology and Infection

Gedruckte Glycan Array: Eine sensible Technik für die Analyse des Repertoires der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat in Kleintiere

Published: February 14, 2019 doi: 10.3791/57662
Automatic Translation
*1, *2,3, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 2,4, 1, 1,5
1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Diese Arbeit zeigt das Potenzial der gedruckten Glycan Array (PGA) Technologie für die Analyse von zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat bei Kleintieren.

Abstract

Das Repertoire des zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat von einem bestimmten Individuum ist häufig verbunden mit seiner immunologischen Status. Nicht nur die einzelnen immun Zustand entscheidet über den Erfolg bei der Bekämpfung von internen und externen potenzielle Bedrohung Signale, sondern auch die Existenz eines bestimmten Musters der zirkulierenden Anti-Glykan Antikörper (und ihren serologischen Ebene Variation) könnte sein, eine deutliche Markierung von der Entstehung und Progression von bestimmten pathologischen Zuständen. Hier beschreiben wir eine gedruckt Glycan Array PGA-basierte Methode, die bietet die Möglichkeit, Hunderte von Glycan Ziele mit sehr hoher Empfindlichkeit zu messen; mit einer minimalen Menge an Beispiel, das ist eine gemeinsame Beschränkung vorhanden, wenn kleine Tiere (Ratten, Mäuse, Hamster, etc.) dienen als Modelle zur Adresse Aspekte menschlicher Krankheiten. Als ein repräsentatives Beispiel für diesen Ansatz zeigen wir die Ergebnisse aus der Analyse des Repertoires der natürlichen Anti-Glykan Antikörper in Mäusen BALB/c. Wir zeigen, dass jede BALB/c Maus an der Studie, trotz genetisch identisch und gepflegt unter den gleichen Bedingungen ein bestimmtes Muster der natürlichen Anti-Kohlenhydrat-Antikörper entwickelt. Diese Arbeit behauptet, die Verwendung von PGA-Technologie zu untersuchen, Repertoire (Besonderheiten) und das Niveau der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrate, in Gesundheit und während jeder Krankheitszustand zu erweitern.

Introduction

Antikörper spielen eine zentrale Rolle in unserer Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger durch direkt neutralisieren Viren1,2 und Bakterien2,3, durch die Aktivierung der Ergänzung System4,5 und die Verbesserung der Phagozytose6. Darüber hinaus sind sie wesentliche Elemente in Krebs targeting und Beseitigung von bösartigen Zellen7und Homöostase Wartung8,9.

Autoimmun-und Entzündungserkrankungen10 und Krebs11können Störungen des Immunsystems führen. Diese pathologischen Bedingungen erfordern idealerweise eine schnelle Diagnose für eine effiziente Behandlung. Bei Autoimmunerkrankungen ist die serologische Präsenz der Autoantikörper in den meisten Fällen ein Prädiktor für die Diagnose von Autoimmunität10,12. Diese Antikörper reagieren mit der Zelloberfläche und extrazelluläre Autoantigene, und sie sind oft seit vielen Jahren vor der Präsentation der Autoimmunerkrankung10,12. Immunschwäche und Krebs sind auch Blutuntersuchungen diagnostiziert, dass entweder immun Elemente wie Antikörper oder ihre funktionelle Aktivität11messen.

Die Identifikation des Repertoires der zirkulierenden Antikörper und ihre serologischen Ebenen sind ausschlaggebend für eine Prognose festlegen und das Fortschreiten der aller genannten pathologischen Bedingungen zu bewerten. Wir haben zuvor das Potenzial der PGA-Technik für die Analyse von zirkulierenden Antikörper in verschiedenen Tierarten13–16, bewiesen, Minimierung des Einsatzes großer Mengen von serologische Proben, Vermeidung des Problems Antikörper Kreuzreaktivität17 und ermöglicht Hochdurchsatz-Profilierung der ein umfangreiches Repertoire an Antikörpern15zugeordnet.

Glykan-basierten Immunoassays sind hauptsächlich bedingt unter anderem durch die Herkunft und Herstellung der Kohlenhydrate, die die Affinität und Bindung des Liganden15,18,19,20 zu bestimmen, ,21. Glykan-basierten Immunoassays können in Suspension (Mikrokügelchen)15,21,22 oder in Wohnung-aktivierte Oberflächen15,21,22entwickelt werden, 23,24. Die letzte gehören ELISA (die meisten konventionellen Methoden) und PGA. Es gibt nicht viele Daten vergleicht man diese Methoden in der gleichen experimentellen Einstellung15,25,26,27. Zuvor haben wir die Wirksamkeit und Selektivität dieser Immunoassays zum Profil Anti-Glykan Antikörper in individuellen menschlichem Plasma Proben15verglichen. Für einige Antikörper wie diese gezielt Anti-A/B-Blutgruppe die Immunoassays konnte sie mit statistischer Signifikanz erkennen und sie positiv korreliert mit einander15,18,21. Unterdessen Anti-P1 Antikörper wurden in erster Linie mit der höchsten Trennschärfe von PGA erkannt, und es gab keine Korrelation in den Feststellungen der verschiedenen Glycan-basierten Immunoassays15,18, 21. diese Unterschiede zwischen den Methoden wurden vor allem im Zusammenhang mit der Antikörper/Antigen-Verhältnis und Glycan Orientierung15. ELISA und Federung Arrays sind anfälliger für unspezifische Bindung als PGA, denn es eine Überschreitung des Antigens Antikörper in diesen Methoden15 gibt. Darüber hinaus ist die Ausrichtung von Glykoproteinen in der PGA restriktiver als in ELISA und Aussetzung Arrays15. ELISA ist praktisch, wenn die Studie eine begrenzte Gruppe von Glykane enthält. ELISA bietet neben Aussetzung Arrays größere Flexibilität im Hinblick auf Assay Neukonfiguration. PGA ist besonders praktisch für Entdeckung Ansätze15,18,21,28. Trotz dieser klaren Vorteile und Nachteile könnte der drei genannten Immunoassays verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Glycan-Antikörper Interaktionen zu studieren. Das endgültige Ziel der Studie ist, dass einerseits die Auswahl geeigneter Methoden leiten wird.

Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, die Verwendung von PGA-Technologie für die Analyse des Repertoires der zirkulierenden Anti-Glykan Antikörper bei kleinen Tieren zu erweitern. Als ein repräsentatives Ergebnis präsentieren wir Ihnen hier ein detailliertes Protokoll, um das Repertoire der natürlichen Anti-Kohlenhydrat-Antikörper bei Erwachsenen BALB/c Mäusen von PGA zu beurteilen.

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Protocol

(1) Glycochips Produktion

  1. Microarray-Vorbereitung
    1. Drucken Sie die Glykoproteinen (50 mM) und Polysaccharide (10 µg/mL) in 300 mM Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 8,5) bei 6 repliziert auf N-Hydroxysuccinimide-derivatisiert Objektträger mit berührungslosen Roboter Arrayer (drop Volumen ~ 900 pL). Jede Folie enthält 4 verschiedene Blöcke Teilgeneratoren (Abbildung 1A, in Farben) 6 Mal wiederholt. Jeder einzelnes Sub-Array besteht aus 112 verschiedene Glycan-Spots, z.B. Steuerelemente (8 Zeilen × 14 Spalten) (Abbildung 1 b).
      Hinweis: In der zusätzlichen Tabelle1kostenfrei Glycan-bezogene Informationen. Die Glycan-Bibliothek für Druck Mikrochips verwendet ergibt sich aus synthetischen langfristige Bemühungen des Teams IBCh; Beispiele für Synthese werden in Publikationen29,30,31,32,33,34,35,36 beschrieben. ,37,38. Die Glycan-Bibliothek enthalten, Blutgruppen-Antigene und zu den häufig vorkommenden terminal Oligosaccharide sowie Kern Motive von Säugetieren N und O verbunden Glykoproteine und Glycolipide, Kohlenhydrat Tumor-assoziierten Antigene, und Polysaccharide von pathogenen Bakterien.
    2. Inkubieren Sie die Folien in Feuchtigkeit-Box (~ 70 % Relative Luftfeuchtigkeit) bei Raumtemperatur (25 ° C) für 1 h.
    3. Blockieren von Microarrays: inkubieren Sie die Folien für 1,5 h mit blockierenden Puffer bei Raumtemperatur (Borsäure 100 mM, 25 mM Ethanolamin, 0,2 % (V/V) Tween-20 Reinstwasser).
    4. Waschen Sie Glycochip mit Reinstwasser zu und trocknen Sie es mit dem Flugzeug.
  2. Glycochip Qualitätskontrolle
    1. Analysieren Sie zwei Microarrays aus jeder Charge mit 1mg/mL Lösung von komplexen Immunglobulin Vorbereitung (CIP, mit IgG, IgM und IgA), 10 µg/mL Lösung biotinylierte Ziege-Anti-Human-Immunglobulin als eine sekundäre Antikörper (IgM + IgG IgA), gefolgt von 1 µg/mL Lösung der entsprechenden fluoreszierende Streptavidin-Konjugat (über Protokoll beschrieben, siehe Schritt 2).
    2. Scannen Sie und analysieren Sie die Glycochips (siehe Schritt 3, Analyse von Glycan Array).
    3. Verwenden Sie Microarray Chargen mit Intra - und inter - chip Korrelation höher als 0,9.

(2) Glycan-Array-Technik

  1. Bereiten Sie die folgenden wässrigen Lösungen (Reinstwasser) und bei Raumtemperatur (25 ° C) lagern:
    • Puffer-1: 1 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS, 1 % (V/V) Tween-20 und 0,01 % (w/V) NaN3
    • Puffer-2: 1 % (w/V) BSA in PBS, 0,1 % (V/V) Tween-20 und 0,01 % (w/V) NaN3.
    • Puffer-3: 0,1 % (V/V) Tween 20 in PBS.
    • Puffer-4: 0,001 % (V/V) Tween 20 in PBS.
  2. Glycochip und Sample-Vorbereitung
    1. Legen Sie die Aufbewahrungsbox mit den Folien auf den Tisch, bis sie Raumtemperatur (25 ° C) erreicht.
      Hinweis: Verwenden Sie puderfreie Latexhandschuhe. Die Glycochip muss durch den Unterteil des gläsernen Objektträger, manipuliert werden, wo der Barcode befindet. Der Barcode hilft Ihnen zu erkennen rechts, vermeiden den Kontakt mit der Oberfläche, wo die Glykane gedruckt werden.
    2. Öffnen Sie den Karton, nehmen Sie die Glycochip und legen Sie es in der Inkubation Kammer (25 ° C), bereits mit nassem Filterpapier konditioniert, um Feuchtigkeit im Inneren der Kammer konstant zu halten.
    3. Unterdessen verdünnen Sie das Mäuse-Serum mit Puffer-1 (01:20) in 1,5 mL-Tuben. Homogenisieren der Serum-Lösung (5 s) mit einem Vortex-Mixer.
      Hinweis: Die Lautstärke benötigt, um ein einzelnes Glycochip Oberfläche völlig decken ist etwa 1 mL.
    4. Brüten Sie nach der Homogenisierung die verdünnte Serum bei 37 ° C für 10 Minuten in einem Wasserbad, Immunglobulin-Aggregation zu vermeiden. Zentrifugieren Sie die Röhren für 3 min bei 10.000 x g und 25 ° C, sammeln Sie den Überstand zu und entsorgen Sie ausgefällten Material.
    5. Legen Sie die Glycochip vorsichtig in die Inkubation Kammer. Inkubieren Sie es für 15 Minuten bei 25 ° C mit 1 mL Puffer-3 Restanhaftungen auf der Oberfläche der Glycochip zu beseitigen.
    6. Die Glycochip in einer vertikalen Position halten und mit einigen Tropfen von Puffer-3 mit einem Kunststoff Pasteurpipette nachwischen. Entfernen Sie vorsichtig den Puffer von der Glycochip Oberfläche mit Filterpapier.
  3. Reaktion: Antikörper binden
    1. Legen Sie die Glycochip in der Inkubation Kammer. Die Glycochip Oberfläche mit einer Mikropipette verdünnte Serumprobe verteilt. Inkubieren Sie mit orbital Agitation (30 u/min) bei 37 ° C für 1,5 h stellen Sie sicher, dass alle trockenen Bereich der Glycochip Oberfläche durch verdünnte Serumprobe mit der Spitze der Pipette abgedeckt ist.
    2. Entfernen Sie alle überschüssige Probe und Tauchen Sie die Glycochip für 5 min in Puffer-3 bei 25 ° C. Dann bewegen Sie die Glycochip in einen Behälter mit Puffer-4 (5 min) und schließlich waschen Sie (5 min) die Glycochip mit Reinstwasser. Zentrifugieren Sie die Glycochip für 1 min bei 175 x g und 25 ° C, die Flüssigkeit zu entfernen.
  4. Erkennung: sekundäre Antikörper
    1. Legen Sie die Glycochip in der Inkubation Kammer. Verteilt auf der Glycochip Oberfläche eine Lösung (5 µg/mL) der Ziege Anti-Maus (IgG + IgM) konjugiert, Biotin in Puffer-2. Inkubieren Sie mit orbital Agitation (30 u/min) bei 37 ° C für 1 h.
    2. Entfernen Sie den ungebundenen Anteil und wiederholen Sie die Waschschritte.
    3. Inkubieren Sie nach der Zentrifugation die Glycochip in der Dunkelheit bei 25 ° C für 45 Minuten (30 u/min) mit 2 µg/mL der entsprechenden Fluorochrom-markierte Streptavidin-Lösung (im Puffer-2).
    4. Entfernen Sie in der Dunkelheit den ungebundenen Anteil zu und wiederholen Sie die Waschschritte.
    5. Trocknen Sie die Glycochip mit dem Flugzeug.
      Hinweis: Glycochip sollten so bald wie möglich gescannt werden. Aber ist es nicht möglich, sofort nach dem färben zu scannen, zu tun, kann Glycochips in der Dunkelheit an einem kühlen und trockenen Ort gelagert.

3. Analyse der Glycan Array

  1. Scannen Sie das array
    1. Lassen Sie die Glycochip auf den Tisch, bis es Raumtemperatur in Dunkelheit erreicht. Zur gleichen Zeit, schalten Sie die Dia-Scanners und der Laser (Erregung Wellenlänge von 633 nm).
    2. Halten Sie die Microarray, schieben Sie die Glycochip in den Schacht, bis er den Rücken berührt.
    3. Scannen der Glycochip ("run easy Scan"), und den Scan als ein ". TIFF"-Datei.
  2. Array-Quantifizierung
    1. Das Array mit einem ScanArray-Analyse-System zu quantifizieren. Öffnen zuvor gescannten Bildern, indem Sie auf "Datei" in der "Configure & Datei-Gruppe" im Hauptfenster (Abbildung 1 b-D)
    2. Laden Sie die entsprechenden Array Dateivorlage im GAL-Format (Disposition der gedruckten Glykane auf dem Objektträger) (Abbildung 1).
    3. Passen Sie GAL Vorlage an, indem Sie sorgfältig das Array ("Grids") mit den Punkten im Bild ausrichten und initiieren Sie Quantifizierung (Abbildung 1) zu.
    4. Wählen Sie die Quantifizierung Parameter:
      • Quantifizierung Typ: Run einfach Quant.
      • Quantifizierungsmethode: Kreis behoben
      • Auto finden Spots: deaktivieren Sie alle Optionen
      • Normalisierung Methode: LOWESS (lokal gewichteten Scatter Plot Glättung).
    5. Sichern Sie die quantifizierten Daten als ". CSV-"Datei (Abbildung 1). Übertragen Sie diese Daten in einer gemeinsamen Tabellenkalkulationsdatei mit Microsoft Excel oder eine andere entsprechende Anwendung.
    6. Der Interquartilbereich (IQR) als die wichtigsten statistischen Methode verwenden: Berechnung des Medians (Quartil 2) aller Signale für jedes Ligand und die interquartile Abweichung (75. und 25. Perzentile oder obere und untere Quartile Q3 und Q1, beziehungsweise).
    7. Führen Sie interaktiven Exploration von Daten mithilfe einer hierarchischen Clustering Explorer-Anwendung aus.
    8. Verwendung clustering Parameter: durchschnittliche Gestänge (UPGMA) und euklidische Entfernung wie Ähnlichkeit Abstand messen. Durchführen Sie hierarchische Cluster von Zeilen ohne Normalisierung.

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Representative Results

Hier präsentieren wir Ihnen eine Zusammenfassung der repräsentative Ergebnisse aus der Quantifizierung des Repertoires der natürlichen Anti-Glykan Antikörper in einer Population von 20 BALB/c Mäuse. Die Glycochips, die in dieser Studie verwendeten enthaltenen 419 verschiedenen Glycan Strukturen. Die meisten Glykane synthetisiert als -CH2CH2CH2NH2 Abstandhalter-bewaffnet O-Glykoside, in mehreren Fällen als -CH2CH2NH2 oder -NHCOCH2NH2 Glykoside. Alle Glycan Strukturen zeichneten sich durch hohe Auflösung (700 - oder 800 MHz) NMR-Spektroskopie, gereinigt und getestet von HPLC, unter Angabe ihrer > 95 % Reinheit. Wir haben gleichzeitig ermittelt IgM + IgG-Anti-Glykan Antikörper aufgrund einer Einschränkung in der Höhe von Maus-Serum. In der PGA werden Werte über 4.000 RFU als ein positives Signal der Antikörperbindung (dieser Wert ist ~ 10 % der oberen Glykane RFU) betrachtet. Die meisten der Leitlinien für die Berichterstattung Glycan Microarray-basierte Daten39folgen in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse. Nur 17 % der Kohlenhydrat-Strukturen demonstriert ≥4, 000 RFU in der PGA (Abbildung 2, rot). Die meisten der Glycan Strukturen in den Glycochips ausgesetzt waren nicht erkannt durch das Repertoire des zirkulierenden Anti-Glykan Antikörper von BALB/c Mäusen (Abbildung 2, in blau und weiß)28. Das erhaltene Muster der natürlichen Anti-Kohlenhydrat-Antikörper von BALB/c enthalten 12 verschiedene Glycan Besonderheiten mit sehr hohe mittlere Signalintensitäten Antikörper binden (≥10, 000 RFU Tabelle 1)28.

Figure 1
Abbildung 1 : Schematische Darstellung (nicht auf der Waage) der Glycan Arraykonfiguration, Druck- und Analyse. (A) gedruckten Mikrochips sind mit einer Bibliothek von 419 verschiedenen Glycan Strukturen, gefolgt von den Nachweis mit einem entsprechenden Eindringmittel beschrifteten sekundäre Antikörper entwickelt. Jede Folie enthält 4 verschiedene Blöcke Teilgeneratoren (in Farben), 6-Mal wiederholt. Jeden einzelnen Sub-Array wird von 112 verschiedenen Glycan Spots (8 Zeilen × 14 Spalten), z.B. Kontrollen gebildet. (B) ein repräsentatives Beispiel für die Bilder von Mikrochip mit einem Fluoreszenz-Scanner Scannen erhalten (Dritter Teil des Bildes). (C) der Prozess der Angleichung der "Grid" stellen in jeder einzelnen Sub-Array (Vorlage Einstellung bei der Quantifizierung). (D) die Fluoreszenz wird für jeden Fleck erkannt und Ergebnisse werden in einer gemeinsamen Tabellenkalkulationsdatei übertragen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Repertoire des natürlichen zirkulierende Anti-Kohlenhydrat-Antikörper von Mäusen BALB/c. Maus Serumproben (01:20) wurden mit der Glycochips inkubiert und mit einem ScanArray-Leser gescannt. Daten wurden mit einem Microarray-Analyse-System analysiert und Ergebnisse wurden in relative Fluoreszenz-Einheiten (RFU) als die mediane ± mittlere absolute Abweichung (MAD) ausgedrückt. Blauen und weiße Farben repräsentieren Bindung Signale niedriger als 4.000 RFU (Hintergrund); rote Farbe steht für Signale ≥4, 000 RFU (positive Bindung). F: weiblich; M: männlich (n = 20). Diese Zahl reproduziert wurde von Bello-Gil, D. Et Al. 28. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Glycan
ID (#)		 Struktur Allgemeiner name Median und MAD as RFU Anzahl von Mäusen zeigen RFU ≥4000 (%)
60 6-O-Su-Galβ-spb 61113 1156 100
271 Galβ1-6Galβ1-4Glcβ-sp 53622 1934 100
802 Galβ1-3GalNAc(furc) β-sp 51348 2324 100
176 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) Glcβ-sp 43008 9342 100
166 GlcAβ1-6Galβ-sp 39105 2993 85
150 3-O-SU-Galβ1-3GalNAcα-SP 37943 3232 100
437 GalNAcα1-3(Fucα1-2) Galβ1-3GalNAcβ-sp A(Type 4) 33886 3193 90
125 6-Bn-Galβ1-4GlcNAcβ-sp 32674 5389 95
154 3-O-SU-Galβ1-3GlcNAcβ-SP 32651 3954 100
177 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) GlcNAcβ-sp 32496 7215 100
287 3-O-Su-Galβ1-3(Fucα1-4) GlcNAcβ-sp SuLeein 20063 4962 95
234 Galβ1-4(Fucα1-3) GlcNAcβ-sp Le-x 13573 2635 80

Tabelle 1: Top Rank Glycan Strukturen erkannt durch natürliche Antikörper von BALB/c Mäusen. Glykane mit Bindung signalisiert über 4.000 RFU in mindestens 80 % der untersuchten Mäuse (n = 20). bbedeutet sp Aminoethyl, Aminopropyl oder Glycyl Abstandhalter. cFuranose; alle anderen Monosaccharide sind in einer Pyranose-Form; Fuc Rückstände hat L-Konfiguration, alle anderen Monosaccharide - D-Konfiguration. Diese Tabelle modifiziert von Bello-Gil, D. Et Al. 28.

Ergänzende Tabelle1: Liste von Glykoproteinen, ihre Bindung an natürlichen zirkulierende Antikörper (IgM + IgG) von BALB/c Mäuse (n = 20), ausgedrückt in relative Fluoreszenz Einheiten (RFU) als Median ± MAD und die Anzahl der Tiere von mehr als schneiden Sie ()≥4000 RFU). Diese Tabelle reproduziert wurde von Bello-Gil, D. Et Al. 28. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterladen

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Discussion

Glycan Microarrays sind unverzichtbare Werkzeuge für die Untersuchung von Protein-Glycan Interaktionen40geworden. Die vorliegende Arbeit beschreibt ein Protokoll basiert auf PGA-Technologie, das Repertoire der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat in den BALB/c Mäusen zu studieren. Da PGA die Möglichkeit, Bildschirm zahlreicher biologisch unbekannten handelt bietet, ist es eine außergewöhnlich günstige Discovery Tool13,15,28. Die vorgeschlagene Methode bietet die Möglichkeit, in die gleiche experimentelle Einstellung, Hunderte von Glycan Strukturen mit einer reduzierten Menge serologische Proben (50 µL) zu messen. Dies ist besonders wichtig bei kleinen Tieren (kleine zirkulierende Blutvolumen), oder wenn man Blut mehrmals aus der gleichen Versuchstier extrahieren muss.

Wir unter Beweis gestellt, als repräsentative Ergebnisse, dass genetisch identische Mäuse nicht als immunologische Mittel betrachtet werden sollte; weil sie unterschiedliche Muster der natürlichen Anti-Kohlenhydrat-Antikörper entwickeln (nur 12 Glycan Besonderheiten wurden konserviert). Serologische Ebenen für den Rest des Repertoires der natürlichen Anti-Kohlenhydrat-Antikörper waren unter den untersuchten Tieren sehr unterschiedlich. Analyse der Darm Microbiota von Inzucht Tiere41 könnte diese Heterogenität42,43,44,45,46erklären. Wenn die Produktion von natürlichen Anti-Glykan Antikörper wird durch den Antigenen Stimulation der Mikrobiota vermittelt, und unterscheidet sich unter Inzucht Mäuse41, werden feine Spezifität dieser Antikörper nicht identisch sein.

Der größte Nachteil für PGA-Entwicklung ist der Zugriff auf wohldefinierte Glycan Strukturen40,47. Glykane produziert in biologischen Systemen sind heterogene40,47,48, und ihre Biosynthese stützt sich auf die differentielle Expression der Kohlenhydrat-Enzyme, wodurch heterogene Mischungen von Glycoforms, Jeder hat eine unterschiedliche physiologische Aktivität47. Die komplexe Zusammensetzung und Konfiguration von der Glykane in biologischen Systemen stellen ihre Produktionen40,47,48eine Herausforderung. Zusammen mit Chemo-enzymatische Synthese bleibt Glykoproteinen aus natürlichen Quellen isoliert die wichtigste Quelle von Glykoproteinen für Arrays Entwicklung40. Synthetische niedrige Renditen und der komplexen Reinigungsprozess von Glykoproteinen und Glykosphingolipide machen die effiziente Produktion von Glykoproteinen im Allgemeinen schwierig40,47,48skalieren. Daher weiterhin die Verfügbarkeit und die Preise von Glykoproteinen eine sehr einschränkende Bedingung, die Verwendung von PGA als ein Discovery-Tool zu erweitern.

Darüber hinaus müssen im Rahmen des Protokolls wichtige Schritte, die vor allem in Bezug auf die richtige Verteilung der Lösungen (Serum, Sekundärantikörper) über die Glycochip Fläche mit Vorsicht ausgeführt werden. Die Methodik erfordert mindestens, 1 mL dieser Lösungen, alle trockenen Bereiche der Glycochip Oberfläche homogen einweichen. Dies ist entscheidend, um minimale Unterschiede zwischen Glycan Wiederholungen zu erhalten und auch übermäßigen Hintergrund bei Quantifizierung zu vermeiden.

Trotz der erwähnten Einschränkungen ist PGA ein sehr empfindlich Werkzeug für Ansätze, die im Zusammenhang mit Protein-Glycan Interaktionen40zu studieren oder um das Repertoire der Anti-Glykan Antikörper in einer bestimmten experimentellen Einstellung oder Zustand13zu studieren, 15,28. Diese Studie kann auf verschiedene Arten (einschließlich Humanproben) 13,15,23,28, bietet eine vielseitige Methode zur Identifizierung von des Repertoires des zirkulierenden extrapoliert werden Anti-Kohlenhydrat-Antikörper.

Wir rechnen auch die Potenzialität, die dieser Ansatz kann bei der frühen Diagnose bringen und abgeleitete Behandlung in einigen von den pathologischen Zuständen, wo Antikörper Glycan Strukturen gerichtet, scheinen eine wichtige Rolle spielen.

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Disclosures

Nailya Khasbiullinaund Alexey Nokel sind Mitarbeiter von Semiotik LLC, die der Lieferant die in dieser Studie verwendeten Glycochips ist.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) gewähren PI13/01098 von Carlos III Health Institute, des spanischen Gesundheitsministeriums. DB-G wurde von einer doctoral Research Position gefördert durch die Europäische Union siebten Rahmenprogramm (RP7/2007-2013) unter Grant Agreement 603049 (TRANSLINK) profitiert. NK, NS, und NB wurde von Grant #14-50-00131 der russischen Science Foundation unterstützt. DB-G will seine Dankbarkeit gegenüber Marta Broto, J. Pablo Salvador und Ana Sanchis für hervorragende technische Unterstützung und Alexander Rakitko um Hilfe bei der statistischen Analyse zum Ausdruck bringen. Mit der Unterstützung der "Pla de Doctorats Industrials De La Secretaria d'Universitats ich Recerca del Departament d'Empresa ich Coneixement De La Generalitat de Catalunya (Gewährungsnummer 2018 DI 021). Wir bedanken uns bei CERCA Programm / Generalitat de Catalunya für institutionelle Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).

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