Summary
Questo lavoro Mostra le potenzialità della tecnologia array (PGA) glycan stampato per l'analisi degli anticorpi anti-carboidrati nei piccoli animali.
Abstract
Il repertorio di anticorpi anti-carboidrati di un dato individuo è spesso associato a sua condizione immunologica. Non solo la condizione immune individuale determina il successo nella lotta contro segnali di minaccia potenziale interne ed esterne, ma anche l'esistenza di un particolare modello di fare circolare gli anticorpi anti-glycan (e la loro variazione di livello sierologica) potrebbe essere un indicatore significativo dell'insorgenza e la progressione di alcune condizioni patologiche. Qui, descriviamo una metodologia basata su stampato Glycan Array PGA che offre l'opportunità di misurare centinaia di obiettivi glycan con sensibilità molto alta; utilizzando una quantità minima di campione, che è un comune restrizione presente quando piccoli animali (ratti, topi, criceto, ecc.) sono utilizzati come modelli per affrontare gli aspetti delle malattie umane. Come un esempio rappresentativo di questo approccio, vi indichiamo i risultati ottenuti dall'analisi del repertorio di anticorpi naturali anti-glycan nei topi BALB/c. Dimostriamo che ogni topo BALB/c coinvolto nello studio, pur essendo geneticamente identico e tenuta sotto le stesse condizioni, si sviluppa un modello particolare di anticorpi anti-carboidrati naturali. Questo lavoro sostiene di espandere l'uso della tecnologia di PGA per studiare il repertorio (specificità) ed i livelli di anticorpi anti-carboidrati, sia nella salute che durante qualsiasi condizione patologica.
Introduction
Gli anticorpi gioca un ruolo centrale nella nostra difesa contro agenti patogeni d'invasione neutralizzando direttamente virus1,2 e batteri2,3, attivando il complemento system4,5 e il potenziamento della fagocitosi6. Inoltre, essi sono elementi essenziali nel cancro di targeting e l'eliminazione delle cellule maligne7e omeostasi manutenzione8,9.
I disordini del sistema immunitario possono provocare1110 e cancro, malattie autoimmuni ed infiammatorie. Tutte queste condizioni patologiche richiedono idealmente una diagnosi rapida per un trattamento efficace. Nel caso di disordini autoimmuni, sierologica presenza di autoanticorpi nella maggior parte dei casi è un preannunciatore per sistema diagnostico di autoimmunità10,12. Questi anticorpi reagiscono con la superficie cellulare ed extracellulare autoantigeni e, sono spesso presenti per molti anni prima della presentazione di malattia autoimmune10,12. Cancro e deficit immunitari sono anche diagnosticati con esami del sangue che sia misurare il livello di sistema immunitario elementi quali gli anticorpi, o la loro attività funzionale11.
L'identificazione del repertorio di fare circolare gli anticorpi ed i loro livelli sierologici sono di primaria importanza per impostare una prognosi e valutare la progressione di tutte le citate condizioni patologiche. Precedentemente abbiamo dimostrato le potenzialità della tecnica di PGA per l'analisi degli anticorpi in diverse specie animali13–16, riducendo al minimo l'uso di grandi volumi di campioni sierologici, evitando il problema associato con gli anticorpi cross-reattività17 e profilatura di alto-rendimento consentendo di un vasto repertorio di anticorpi15.
Basato su glycan immunoassays principalmente sono condizionati, tra altri fattori, l'origine e la produzione di carboidrati, che determinano l'affinità e l'associazione di ligandi15,18,19,20 ,21. Basato su glycan test immunologici possono essere sviluppati in sospensione (microsfere)15,21,22 o in superfici piatto-attivato15,21,22, 23,24. L'ultimo includono ELISA (il più convenzionale di questi metodi) e PGA. Non c'è la quantità di dati confrontando queste metodologie la stessa impostazione sperimentale15,25,26,27. In precedenza abbiamo confrontato l'efficacia e la selettività di questi test immunodiagnostici per gli anticorpi anti-glycan profilo in campioni di plasma umano individuale15. Per alcuni anticorpi come quelli gruppo di sangue anti-A/B targeting, tutti i test immunologici potrebbero individuarli con significatività statistica e hanno correlato positivamente con la vicenda15,18,21. Nel frattempo, gli anticorpi anti-P1 principalmente sono stati rilevati da PGA con il più alto potere discriminante, e non c'era correlazione alle determinazioni fatta da diversi basati su glycan immunoassays15,18, 21. queste differenze tra metodi riguardavano principalmente l'antigene/anticorpo rapporto e glycan orientamento15. Le matrici di ELISA e sospensione sono più suscettibili di associazione aspecifici che PGA perché c'è un eccesso di antigene rispetto gli anticorpi in questi metodi15. Inoltre, l'orientamento dei glicani in PGA è più limitato rispetto a ELISA e sospensione matrici15. ELISA è comoda quando lo Studio include un pannello limitato di glicani. Insieme a matrici di sospensione, ELISA offre più ampia flessibilità per quanto riguarda la riconfigurazione di dosaggio. PGA è eccezionalmente conveniente per scoperta approcci15,18,21,28. Nonostante questi chiari vantaggi e svantaggi, i tre test immunologici accennati potrebbero essere utilizzati per studiare diversi aspetti delle interazioni glycan-anticorpo. L'obiettivo finale dello studio è che quello guiderà la selezione della metodologia più adatta.
Il presente lavoro si propone di estendere l'uso della tecnologia di PGA per l'analisi del repertorio di anticorpi anti-glycan nei piccoli animali. Come un risultato rappresentativo, presentiamo qui un protocollo dettagliato per valutare il repertorio di anticorpi anti-carboidrati naturali in topi BALB/c adulti di PGA.
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Protocol
1. Glycochips produzione
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Preparazione di microarray
- Stampare i glicani (50 mM) e polisaccaridi (10 µ g/mL) in 300 millimetri di fosfato soluzione salina tamponata (PBS, pH 8.5) alle 6 replica su N-Idrossisuccinimide-derivatizzati vetrini, utilizzo di non-contatto arrayer robotico (drop volume ~ 900 pL). Ogni diapositiva contiene 4 diversi blocchi di sottomatrici (Figura 1A, a colori) ripetuti 6 volte. Ogni singola matrice secondaria è formata da 112 glycan diversi luoghi, tra cui controlli (8 righe × 14 colonne) (Figura 1B).
Nota: Informazioni relative alla Glycan sono forniti nel complementare nella tabella 1. La biblioteca di glycan utilizzata per stampa microchip è il risultato di uno sforzo a lungo termine sintetico della squadra Iannuzzi; esempi di sintesi sono descritti nelle pubblicazioni relative29,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38. La libreria glycan incluso antigeni dei gruppi sanguigni e alcuni tra i più frequentemente d'avvenimento oligosaccaridi terminali, così come motivi di nucleo di mammiferi N - e O-collegata di glicoproteine e glicolipidi, antigeni tumore-collegati del carboidrato, e polisaccaridi da batteri patogeni. - Incubare i vetrini in casella di umidità (~ 70% di umidità relativa) a temperatura ambiente (25 ° C) per 1 h.
- Blocco di microarrays: Incubare i vetrini per 1,5 h con tampone bloccante a temperatura ambiente (acido borico 100mm, etanolammina 25 mM, 0,2% (v/v) di Tween-20 in acqua ultrapura).
- Lavare la glycochip con acqua ultrapura e asciugarlo in aereo.
- Stampare i glicani (50 mM) e polisaccaridi (10 µ g/mL) in 300 millimetri di fosfato soluzione salina tamponata (PBS, pH 8.5) alle 6 replica su N-Idrossisuccinimide-derivatizzati vetrini, utilizzo di non-contatto arrayer robotico (drop volume ~ 900 pL). Ogni diapositiva contiene 4 diversi blocchi di sottomatrici (Figura 1A, a colori) ripetuti 6 volte. Ogni singola matrice secondaria è formata da 112 glycan diversi luoghi, tra cui controlli (8 righe × 14 colonne) (Figura 1B).
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Controllo di qualità Glycochip
- Analizzare due microarrays da ogni batch utilizzando 1mg/mL soluzione di preparazione complessa dell'immunoglobulina (CIP, contenenti IgG, IgM e IgA), 10 µ g/mL di soluzione di immunoglobuline anti-umano di biotinylated capra come un anticorpo secondario (IgM + IgG e IgA), seguita da 1 µ g/mL soluzione del coniugato fluorescente streptavidina corrispondente (tramite il protocollo descritto di seguito, vedere il passaggio 2).
- Scansione e analizzare il glycochips (vedere il passaggio 3, analisi di glycan array).
- Utilizzo di microarray batch con correlazione superiore a 0,9 intra - e inter - chip.
2. tecnica Glycan Array
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Preparare le seguenti soluzioni acquose (in acqua ultrapura) e conservarle a temperatura ambiente (25 ° C):
- Tampone-1: 1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) in PBS, 1% (v/v) di Tween-20 e 0,01% (p/v) NaN3
- Tampone-2: 1% (p/v) BSA in PBS, 0.1% Tween-20 (v/v) e 0,01% (p/v) di NaN3.
- Tampone-3: 0,1% (v/v) Tween-20 in PBS.
- Buffer-4: 0,001% (v/v) Tween-20 in PBS.
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Glycochip e preparazione di campioni
- Mettere il contenitore con le diapositive sul tavolo finché non raggiungono la temperatura ambiente (25 ° C).
Nota: Utilizzare guanti in lattice senza polvere. Il glycochip deve essere manipolato da parte inferiore della lastra di vetro, dove si trova il codice a barre. Il codice a barre vi aiuterà a identificare il lato destro, evitando il contatto con la superficie dove i glicani sono stampati. - Aprire la scatola, prendere la glycochip e posizionarlo nella camera di incubazione (25 ° C), già condizionata con filtro di carta bagnato per mantenere costante l'umidità all'interno della camera.
- Nel frattempo, diluire il siero di topi con Buffer-1 (01:20) in provette da 1,5 mL. Omogeneizzare la soluzione del siero (5 s) con un Vortex.
Nota: Il volume necessario per coprire completamente una superficie singola glycochip è di circa 1 mL. - Dopo l'omogeneizzazione, incubare il siero a 37 ° C per 10 min in un bagno d'acqua per evitare l'aggregazione dell'immunoglobulina. Centrifugare le provette per 3 min a 10.000 x g e a 25 ° C, raccogliere il surnatante e scartare qualsiasi materiale precipitato.
- Posizionare con attenzione il glycochip nella camera di incubazione. Incubare per 15 minuti a 25 ° C con 1 mL di tampone-3 per eliminare qualsiasi materiale residuo sulla superficie della glycochip.
- Tenere il glycochip in posizione verticale e rewash esso con qualche goccia di tampone-3 usando una pipetta di Pasteur plastica. Rimuovere con cautela il buffer dalla superficie glycochip utilizzando carta da filtro.
- Mettere il contenitore con le diapositive sul tavolo finché non raggiungono la temperatura ambiente (25 ° C).
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Reazione: gli anticorpi associazione
- Posto il glycochip nella camera di incubazione. Stendere il campione di siero diluito su glycochip la superficie utilizzando una micropipetta. Incubare con agitazione orbitale (30 giri) a 37 ° C per 1,5 h. Assicurarsi che tutti i secchi dell'area di glycochip è coperto dal campione di siero diluito usando la punta della pipetta.
- Rimuovere qualsiasi campione in eccesso e immergere il glycochip per 5 min in Buffer-3 a 25 ° C. Quindi, spostare il glycochip in un contenitore con Buffer-4 (5 min) e infine lavare (5 min) il glycochip con acqua ultrapura. Centrifugare il glycochip per 1 min a 175 x g e 25 ° C per rimuovere il liquido.
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Rilevazione: anticorpo secondario
- Posto il glycochip nella camera di incubazione. Si è diffusa su tutta la superficie di glycochip una soluzione (5 µ g/mL) di capra anti-topo (IgG + IgM) coniugato di biotina nel Buffer-2. Incubare con agitazione orbitale (30 giri) a 37 ° C per 1 h.
- La frazione non legata di rimuovere e ripetere i passaggi di lavaggio.
- Dopo la centrifugazione, incubare la glycochip nel buio a 25 ° C per 45 min (30 giri) con 2 µ g/mL della soluzione di fluorocromo-labeled streptavidin corrispondente (in tampone-2).
- Nel buio, la frazione non legata di rimuovere e ripetere i passaggi di lavaggio.
- Asciugare il glycochip di aria.
Nota: Glycochip deve essere analizzato più presto possibile. Ma se è Impossibile eseguire la scansione immediatamente dopo la colorazione, glycochips possono essere memorizzati in un luogo fresco e asciutto nelle tenebre.
3. analisi di Glycan Array
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Scansione della matrice
- Lasciare la glycochip sul tavolo finché raggiunge la temperatura ambiente buio. Allo stesso tempo, accendere il scanner per diapositive e il laser (lunghezza d'onda di eccitazione di 633 nm).
- Tenendo il microarray, far scorrere il glycochip nello slot fino a toccare la parte posteriore.
- Acquisire il glycochip ("run easy scan") e salvare la scansione come un ". File TIFF".
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Quantificazione di matrice
- Quantificare la matrice utilizzando un sistema di analisi ScanArray. Apri immagini, precedentemente acquisite facendo clic su "File" nel "gruppo Configura & File" nella finestra principale (Figura 1B-D)
- Caricare il modello di file matrice corrispondente in formato GAL (disposizione dei glicani stampato su vetrino) (Figura 1).
- Regolare GAL modello allineando attentamente la matrice (griglie) con i punti sull'immagine e avviare quantificazione (Figura 1).
- Selezionare i parametri di quantificazione:
- Tipo di quantificazione: Quant di facile esecuzione.
- Metodo di quantificazione: cerchio fisso
- Trova automaticamente le macchie: deseleziona tutte le opzioni
- Metodo di normalizzazione: LOWESS (localmente ponderata Scatter Plot levigante).
- Salvare i dati quantificati come ". File CSV"(Figura 1). Trasferire i dati in un file di foglio di calcolo comuni utilizzando Microsoft Excel o un'altra applicazione appropriata.
- Utilizzare lo scarto interquartile (IQR) come il principale metodo di statistico: calcolo della mediana (Quartile 2) di tutti i segnali per ogni ligando e lo scarto interquartile (75 ° e 25 percentili o quartili superiori ed inferiori Q3 e Q1, rispettivamente).
- Eseguire l'esplorazione interattiva dei dati utilizzando un'applicazione Explorer Clustering gerarchico.
- Utilizzo di parametri di clustering: sollevatore medio (UPGMA) e la distanza euclidea come somiglianza distanza di misura. Eseguire il clustering gerarchico di righe senza normalizzazione.
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Representative Results
Qui, presentiamo una sintesi dei risultati rappresentativi ottenuti dalla quantificazione del repertorio di anticorpi naturali anti-glycan in una popolazione di 20 topi BALB/c. Il glycochips utilizzato in questo studio conteneva 419 glycan diverse strutture. Maggior parte dei glicani sono stati sintetizzati come -CH2CH2CH2NH2 distanziatore-armati O-glicosidi, in diversi casi come -CH2CH2NH2 o - NHCOCH2NH2 glicosidi. Tutte le strutture di glycan sono state caratterizzate da alta risoluzione (700 - o 800 MHz) spettroscopia NMR, purificato e testato da HPLC, indicando loro > 95% di purezza. Siamo contemporaneamente hanno determinato IgM + IgG anticorpi anti-glycan a causa di una restrizione della quantità di siero di topo. In PGA, abbiamo considerato i valori superiori a 4.000 RFU come un segnale positivo di grippaggio dell'anticorpo (questo valore è ~ 10% dei glicani superiore RFU). I risultati presentati in questo lavoro seguono la maggior parte delle linee guida per il reporting di dati basati su microarray glycan39. Solo il 17% delle strutture di carboidrati ha dimostrato ≥ 4, 000 RFU in PGA (Figura 2, in rosso). Maggior parte di glycan strutture esposte nella glycochips non sono stati riconosciuti dal repertorio di anticorpi anti-glycan di topi BALB/c (Figura 2, in blu e bianco)28. Il modello conservato di anticorpi anti-carboidrati naturali di BALB/c incluso 12 glycan diverse specificità, con intensità molto alta del segnale mediano di anticorpi vincolanti (≥ 10, 000 RFU tabella 1)28.
Figura 1 : Rappresentazione schematica (non in scala) della configurazione dell'array glycan, stampa e analisi. (A) stampati microchip sono sviluppati con una libreria di 419 glycan diverse strutture, seguite dal rilevamento con un anticorpo secondario fluorescente contrassegnato appropriato. Ogni diapositiva contiene 4 diversi blocchi di sottomatrici (a colori), ripetuti 6 volte. Ogni singola matrice secondaria è formata da 112 glycan diversi punti (8 righe × 14 colonne), inclusi i controlli. (B) un esempio rappresentativo delle immagini ottenute da microchip scansione utilizzando uno scanner di fluorescenza (terza parte dell'immagine). (C) il processo di allineamento della "griglia" a punti in ogni singola matrice secondaria (regolazione di modello durante la quantificazione). (D) la fluorescenza è rilevata per ogni spot e risultati sono trasferiti in un comune file di foglio di calcolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Repertorio di anticorpi anti-carboidrati circolazione naturali dei topi BALB/c. Campioni di siero del mouse (01:20) sono stati incubati con il glycochips e analizzati utilizzando un lettore di ScanArray. I dati sono stati analizzati con un sistema di analisi di microarray e risultati sono stati espressi in unità di fluorescenza relativa (RFU) come la mediana ± deviazione assoluta mediana (MAD). Colori bianchi e blu rappresentano i segnali di associazione inferiore a 4.000 RFU (sfondo); colore rosso rappresenta segnali ≥ 4, 000 RFU (associazione positiva). F: femmina; M: maschio (n = 20). Questa figura è stato riprodotto da Bello-Gil, d. et al. 28. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Glycan ID (N.) |
Struttura | Nome comune | Mediana e MAD come RFU | Numero di topi che mostrano ≥ 4000 RFU (%) | |||
| 60 | 6-O-Su-Galβ-spb | 61113 | 1156 | 100 | |||
| 271 | Galβ1-6Galβ1-4Glcβ-sp | 53622 | 1934 | 100 | |||
| 802 | Galβ1-3GalNAc(furc) β-sp | 51348 | 2324 | 100 | |||
| 176 | 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) Glcβ-sp | 43008 | 9342 | 100 | |||
| 166 | GlcAβ1-6Galβ-sp | 39105 | 2993 | 85 | |||
| 150 | 3-O-su-Galβ1-3GalNAcα-SP | 37943 | 3232 | 100 | |||
| 437 | GalNAcα1-3(Fucα1-2) Galβ1-3GalNAcβ-sp | A(Type 4) | 33886 | 3193 | 90 | ||
| 125 | 6-Bn-Galβ1-4GlcNAcβ-sp | 32674 | 5389 | 95 | |||
| 154 | 3-O-su-Galβ1-3GlcNAcβ-SP | 32651 | 3954 | 100 | |||
| 177 | 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) GlcNAcβ-sp | 32496 | 7215 | 100 | |||
| 287 | 3-O-Su-Galβ1-3(Fucα1-4) GlcNAcβ-sp | SuLeun | 20063 | 4962 | 95 | ||
| 234 | Galβ1-4(Fucα1-3) GlcNAcβ-sp | Lex | 13573 | 2635 | 80 | ||
Tabella 1: strutture Top rank glycan riconosciuti dagli anticorpi naturali dei topi BALB/c. Glicani con associazione segnali sopra 4.000 RFU in almeno l'80% di esaminato topi (n = 20). bsignifica sp amminoetil, amminopropil o glycyl distanziale. cfuranosico; tutti gli altri monosaccaridi sono in una forma di piranosio; FUC residuo ha L-configurazione, tutti gli altri monosaccaridi - D-configurazione. Questa tabella è stata modificata da Bello-Gil, d. et al. 28.
Complementare tabella 1: elenco dei glicani, loro grippaggio a naturali anticorpi circolanti (IgM + IgG) di topi BALB/c (n = 20), espressa in unità di fluorescenza relativa (RFU) come mediano ± MAD e il numero di animali superiore a tagliato fuori (≥4000 RFU). Questa tabella è stato riprodotto da Bello-Gil, d. et al. 28. per favore clicca qui per scaricare questa tabella
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Discussion
Glycan microarrays sono diventati strumenti indispensabili per lo studio di interazioni proteina-glycan40. Il presente lavoro descrive un protocollo basato su tecnologia di PGA per studiare il repertorio della circolazione di anticorpi anti-carboidrati nei topi BALB/c. Dal PGA offre la possibilità ad un gran numero di schermo di glicani biologicamente sconosciuto, è una scoperta eccezionalmente conveniente strumento13,15,28. Il metodo proposto offre la possibilità di misurare, la stessa impostazione sperimentale, centinaia di strutture glycan utilizzando una ridotta quantità di campione sierologico (50 µ l). Ciò è particolarmente importante nel caso di animali di piccole taglia (piccolo volume di sangue circolante), o quando è necessario estrarre sangue parecchie volte dallo stesso animale sperimentale.
Abbiamo dimostrato, come risultati rappresentativi, che topi geneticamente identici non dovrebbero essere considerati come equivalenti ad azione immunologici; perché si sviluppano diversi modelli di anticorpi anti-carboidrati naturali (solo 12 glycan specificità sono state conservate). Sierologici livelli per il resto del repertorio di anticorpi anti-carboidrati naturali varia notevolmente tra gli animali esaminati. Analisi del microbiota dell'intestino di animali inbred41 potrebbero spiegare questa eterogeneità42,43,44,45,46. Se la produzione di anticorpi naturali anti-glycan è mediata dalla stimolazione antigenica del microbiota, e questo è diverso tra topi inbred41, fine specificità di questi anticorpi non sarà identico.
Lo svantaggio principale per lo sviluppo di PGA è l'accesso alle strutture ben definite glycan40,47. Glicani prodotte nei sistemi biologici sono eterogenei40,47,48, e loro biosintesi si basa sull'espressione differenziale di enzimi del carboidrato, conseguente miscele eterogenee di glicoforme, ciascuno con una distinta attività fisiologica47. La complessa composizione e configurazione dei glicani presenti nei sistemi biologici fanno loro produzioni impegnativo40,47,48. Insieme a chemio-enzimatico di sintesi, glicani isolato da fonti naturali continuerà ad essere la fonte principale di glicani per matrici sviluppo40. Basso sintetico cede e il processo di depurazione complessi da glicoproteine e glicosfingolipidi rendono la produzione efficiente di glicani a grande scala difficile40,47,48. Quindi, la disponibilità e i prezzi dei glicani continuano ad essere una condizione molto limita per espandere l'uso di PGA come uno strumento di scoperta.
Inoltre, all'interno del protocollo, passaggi critici, soprattutto in materia per la distribuzione corretta delle soluzioni (siero, anticorpi secondari) sopra la superficie di glycochip devono essere eseguite con cautela. La metodologia richiede, almeno, 1 mL di queste soluzioni, in modo omogeneo ammollo asciutte tutte le aree della superficie glycochip. Questo è fondamentale per ottenere differenze minime tra glycan replicati e anche per evitare di fondo eccessivo durante la quantificazione.
Nonostante le limitazioni citate, PGA è uno strumento molto sensibile per approcci correlati allo studio di interazioni proteina-glycan40, o per studiare il repertorio degli anticorpi anti-glycan in una particolare impostazione sperimentale o condizione13, 15,28. Questo studio può essere estrapolato a specie diverse (tra cui campioni umani) 13,15,23,28, offrendo una metodologia versatile per l'identificazione del repertorio del circolante anticorpi anti-carboidrati.
Prevediamo anche le potenzialità che questo approccio può portare nella diagnosi precoce e trattamento derivato in alcune condizioni patologiche dove anticorpi diretti alle strutture glycan sembrano svolgere un ruolo importante.
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Disclosures
Nailya Khasbiullinae Alexey Nokel sono dipendenti di Semiotik LLC, che è il fornitore di glycochips utilizzato in questo studio.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) concedere PI13/01098 da Carlos III Health Institute, Ministero della salute spagnolo. DB-G è stato beneficiato da una posizione di post-dottorato di ricerca finanziata dal Unione europea settimo programma quadro (FP7/2007-2013) sotto il 603049 di accordo Grant (TRANSLINK). Lavoro di NK, NS e NB è stato supportato da grant #14-50-00131 di russo Science Foundation. DB-G vuole esprimere la sua gratitudine a Marta Broto, J. Pablo Salvador e Ana Sanchis per l'eccellente assistenza tecnica e Alexander Rakitko per assistenza nell'analisi statistica. Con il supporto della "Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d'Universitats ho Recerca del Departament aziendali ho Coneixement Gestio Guida de la Generalitat de Catalunya (grant numero 2018 DI 021). Ringraziamo CERCA programma / Generalitat de Catalunya per sostegno istituzionale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| biotinylated goat anti-human Igs | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Ref. #: 31782 | |
| biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: 31807 | |
| Equipment | |||
| Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5 | Scienion AG, Berlin, Germany | http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/ | |
| Stain Tray (slide incubation chamber) | Simport, Beloeil, QC, Canada | Ref. #: M920-2 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | Ref. #: 5810 R | |
| Pipettes | Gilson, Middleton, WI, USA | http://www.gilson.com/en/Pipette/ | |
| Slide Scanner | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | ScanArray GX Plus | |
| Shaking incubator | Cole-Parmer, Staffordshire, UK | Ref. #: SI50 | |
| Biological samples | |||
| BALB/c mice sera | This paper | N/ A | |
| Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) | Immuno-Gem, Moscow, Russia | http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531 | |
| Chemicals, Reagents and Glycans | |||
| Glycan library | Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia | N/ A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, | Ref. #: A9418 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | Ref. #: 411000 | |
| Tween-20 | Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain | Ref. #: 655204 | |
| Phospahte buffered saline (PBS) | VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain | Ref. #: E404 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Ref. #: S2002 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: S21381 | |
| Streptavidin Cy5 conjugate | GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK | Ref. #: PA45001 | |
| Materials | |||
| N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H | Schott-Nexterion, Jena, Germany | Ref. #: 1070936 | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | Ref. #: WHA10347509 | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Ref. #: 0030120086 | |
| Software and algorithms | |||
| ScanArray Express Microarray Analysis System | PerkinElmer | http://www.per | |
| kinelmer.com/microarray | |||
| Hierarchical Clustering Explorer application | University of Maryland, MD, USA | http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/ |
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