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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Matriz de glicano impressa: Uma técnica sensível para a análise do repertório de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação

Published: February 14, 2019 doi: 10.3791/57662
Automatic Translation
*1, *2,3, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 2,4, 1, 1,5
1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Este trabalho mostra o potencial da tecnologia de matriz (PGA) glicano impressa para a análise de anticorpos anti-hidrato de carbono em pequenos animais em circulação.

Abstract

O repertório de anticorpos anti-hidrato de carbono de um determinado indivíduo em circulação é frequentemente associado com seu estado imunológico. Não só a condição de imune individual determina o sucesso na luta contra os sinais de ameaça potencial interno e externo, mas também a existência de um determinado padrão de circulação de anticorpos antiglicano (e sua variação de nível serológica) poderia ser um marcador de significativa do aparecimento e progressão de certas condições patológicas. Aqui, descrevemos uma metodologia baseada em impresso glicano matriz PGA que oferece a oportunidade de medir centenas de glicano alvos com altíssima sensibilidade; usando uma quantidade mínima de amostra, que é um comum animais de presente quando pequena restrição (ratos, ratos, hamster, etc.) são usados como modelos para os aspectos de endereço de doenças humanas. Como um exemplo representativo desta abordagem, mostramos os resultados obtidos a partir da análise do repertório de anticorpos antiglicano natural em camundongos BALB/c. Demonstramos que cada rato BALB/c envolvido no estudo, apesar de ser geneticamente idêntico e mantida sob as mesmas condições, desenvolve um padrão específico de anticorpos anticarboidratos naturais. Este trabalho pretende expandir o uso da tecnologia de PGA para investigar o repertório (especificidades) e os níveis de anticorpos anti-hidratos de carbono, tanto na saúde e durante qualquer condição patológica em circulação.

Introduction

Os anticorpos desempenham um papel central em nossa defesa contra invasores patogénicos neutralizando diretamente vírus1,2 e bactérias2,3, ativando o sistema complemento4,5 e o reforço da fagocitose6. Além disso, eles são elementos essenciais no direcionamento de câncer e eliminação das células malignas7e homeostase manutenção8,9.

Distúrbios do sistema imunológico podem resultar em doenças auto-imunes e inflamatórias câncer de10 e11. Todas essas condições patológicas, idealmente, exigir um diagnóstico alerta para um tratamento eficiente. No caso de doenças auto-imunes, a presença serológica de auto-anticorpos na maioria dos casos é um predictor para diagnóstico de auto-imunidade10,12. Estes anticorpos reagem com a superfície da célula e extracelulares auto-antigénios e, muitas vezes estão presentes por muitos anos antes da apresentação da doença auto-imune10,12. Câncer e deficiências imunológicas também são diagnosticados com exames de sangue que quer medir o nível de elementos imunes, tais como anticorpos, ou sua atividade funcional11.

A identificação do repertório de anticorpos e seus níveis sorológicos de circulação são fundamentais para definir um prognóstico e avaliar a progressão de todas as mencionadas condições patológicas. Nós anteriormente demonstraram o potencial da técnica do PGA para a análise da circulação anticorpos em diferentes espécies animais13–16, minimizando o uso de grandes volumes de amostras serológicas, evitando o problema associados de reatividade cruzada de anticorpos17 e permitindo elevado-throughput de perfil de um extenso repertório de anticorpos15.

Baseado em glicano imunoensaios são principalmente condicionados, entre outros fatores, pela origem e produção de hidratos de carbono, que determinam a afinidade e ligação de ligantes15,18,19,20 ,21. Os imunoensaios baseados em glicano podem ser desenvolvidos em suspensão (microesferas)15,21,22 , ou em superfícies plana-ativado15,21,22, 23,24. Os últimos incluem o ELISA (o mais convencional desses métodos) e PGA. Não há muitos dados comparando estas metodologias na mesma configuração experimental15,25,26,27. Nós anteriormente compararam a eficácia e seletividade destes imunoensaios para anticorpos antiglicano de perfil em amostras de plasma humano individual15. Para alguns anticorpos como aqueles direcionamento anti-A/B Grupo de sangue, todos os imunoensaios podem detectá-los com significância estatística e eles positivamente correlacionaram com os outros15,18,21. Enquanto isso, os anticorpos anti-P1 foram detectados principalmente pela PGA com a mais alta potência discriminativa, e não houve correlação nas determinações feitas por diferentes baseados em glicano imunoensaios15,18, 21. estas diferenças entre os métodos foram principalmente relacionadas com o anticorpo/antigénio ratio e glicano orientação15. Matrizes de ELISA e suspensão são mais suscetíveis a vinculação inespecíficas que PGA, porque há um excesso de antígeno sobre anticorpos nestes métodos15. Além disso, a orientação dos glicanos em PGA é mais restrita do que em matrizes de ELISA e suspensão15. ELISA é conveniente quando o estudo inclui um painel limitado dos glicanos. Juntamente com matrizes de suspensão, ELISA oferece maior flexibilidade em relação a reconfiguração do ensaio. PGA é extremamente conveniente para descoberta abordagens15,18,21,28. Apesar destas claras vantagens e desvantagens, os três mencionados imunoensaios poderiam ser usados para estudar os diferentes aspectos das interações glicano-anticorpo. O objetivo final do estudo é o que guiará a seleção da metodologia mais adequada.

O presente trabalho tem como objetivo estender o uso da tecnologia de PGA para a análise do repertório de anticorpos antiglicano em pequenos animais em circulação. Como um resultado representativo, apresentamos aqui um protocolo detalhado para avaliar o repertório de anticorpos anticarboidratos naturais em adultos camundongos BALB/c pela PGA.

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Protocol

1. Glycochips produção

  1. Preparação de Microarray
    1. Imprimir os glicanos (50mm) e polissacarídeos (10 µ g/mL) em fosfato de 300mm, solução salina tamponada (PBS, pH 8,5) em 6 repetições em lâminas de vidro de N-Hidroxisuccinimida-derivatizado, usando o contato não-robótico arrayer (queda de volume de ~ 900 pL). Cada slide contém 4 blocos de diferentes matrizes sub (figura 1A, em cores) repetidos 6 vezes. Cada submatriz único é formado por 112 glicano diferentes pontos, incluindo controles (8 linhas × 14 colunas) (figura 1B).
      Nota: Informações relacionadas ao glicano são fornecidas na tabela complementar 1. A biblioteca de glicano usada para impressão "microchips" é o resultado de um esforço sintético a longo prazo da equipe IBCh; exemplos de síntese são descritos em publicações relacionadas29,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38. A biblioteca de glicano incluído antígenos do grupo sanguíneo e alguns dos mais frequentemente ocorrendo oligossacarídeos terminais, bem como os motivos de núcleo dos mamíferos N - e O-ligados glicoproteínas e glicolipídios, antígenos de carboidrato associada a tumor, e polissacarídeos de bactérias patogênicas.
    2. A incubar em caixa de umidade (umidade relativa ~ 70%) à temperatura ambiente (25 ° C) por 1h.
    3. Bloqueio de microarrays: a incubar por 1,5 h com tampão de bloqueio à temperatura ambiente (ácido bórico de 100mm, etanolamina 25 mM, 0,2% (v/v) em água ultrapura de Tween-20).
    4. Lavar o glycochip com água ultrapura e secá-la pelo ar.
  2. Controle de qualidade de Glycochip
    1. Analisar dois microarrays de cada lote usando 1mg/mL solução de preparação complexo imunoglobulina (CIP, contendo IgG, IgM e IgA), 10 µ g/mL da solução de imunoglobulinas de anti-humano biotinilado cabra como um anticorpo secundário (IgM + IgG + IgA), seguido de 1 µ g/mL solução do conjugado fluorescente streptavidin correspondente (via protocolo descrito abaixo, consulte a etapa 2).
    2. Digitalizar e analisar o glycochips (consulte a etapa 3, análise da matriz de glicano).
    3. Use lotes de microarray com chip intra e inter correlação superior a 0,9.

2. glicano matriz técnica

  1. Preparar as seguintes soluções aquosas (em água ultrapura) e armazená-los em temperatura ambiente (25 ° C):
    • 1-tampão: 1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) em PBS, 1% (v/v) Tween-20 e 0,01% (p/v) de NaN3
    • Tampão-2: 1% (p/v) BSA em PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 e 0,01% (p/v) de NaN3.
    • 3-tampão: 0,1% (v/v) Tween-20 em PBS.
    • 4-tampão: 0,001% (v/v) Tween-20 em PBS.
  2. Preparação de Glycochip e amostra
    1. Coloque a caixa de armazenamento com os slides sobre a mesa, até atingirem a temperatura ambiente (25 ° C).
      Nota: Utilize luvas de látex sem pó. O glycochip deve ser manipulado pela parte inferior da lâmina de vidro, onde se encontra o código de barras. O código de barras vai ajudar você a identificar o lado direito, evitando o contato com a superfície onde os glicanos são impressos.
    2. Abrir a caixa, pegue o glycochip e colocá-lo na câmara de incubação (25 ° C), já condicionada com papel de filtro molhado a manter a umidade constante no interior da câmara.
    3. Enquanto isso, dilua o soro de ratos com Buffer-1 (01:20) em tubos de 1,5 mL. Homogeneizar a solução de soro (5 s) com um misturador do vortex.
      Nota: O volume necessário para cobrir totalmente uma superfície única glycochip é aproximadamente de 1 mL.
    4. Após a homogeneização, incube o soro diluído a 37 ° C por 10 min em um banho de água para evitar a agregação de imunoglobulina. Centrifugar os tubos por 3 min em 10.000 x g e 25 ° C, recolher o sobrenadante e descartar qualquer material precipitado.
    5. Coloque o glycochip cuidadosamente em câmara úmida. -Incube por 15 min a 25 ° C, com 1 mL de tampão-3 para eliminar qualquer material residual na superfície do glycochip.
    6. Mantenha o glycochip na posição vertical e rewash-lo com algumas gotas de Buffer-3 utilizando uma pipeta Pasteur plástica. Cuidadosamente remova o tampão da superfície glycochip usando papel de filtro.
  3. Reação: ligação de anticorpos
    1. Coloca o glycochip na câmara de incubação. Espalhe a amostra de soro diluído sobre a superfície de glycochip utilizando uma micropipeta. Incube com agitação orbital (30 rpm) a 37 ° C por 1,5 h. Certifique-se de que toda a área seca da superfície glycochip é coberta pela amostra de soro diluído, usando a ponta da pipeta.
    2. Retire qualquer excesso amostra e mergulhe o glycochip por 5 min em Buffer-3 a 25 ° C. Em seguida, mover o glycochip para um contêiner com Buffer-4 (5 min) e finalmente lavar o glycochip com água ultrapura (5 min). Centrifugue a glycochip por 1 min em 175 x g e 25 ° C, para remover o líquido.
  4. Deteção: anticorpo secundário
    1. Coloca o glycochip na câmara de incubação. Espalhe sobre a superfície de glycochip uma solução (5 µ g/mL), de cabra anti-rato (IgG + IgM) conjugada com biotina em Buffer-2. Incube com agitação orbital (30 rpm) a 37 ° C por 1h.
    2. Remover a fração não acoplada e repita as etapas de lavagem.
    3. Após a centrifugação, incube o glycochip na escuridão a 25 ° C, durante 45 min (30 rpm) com 2 µ g/mL da solução de correspondente streptavidin fluorocromo-rotulado (no Buffer-2).
    4. Na escuridão, remover a fração não acoplada e repita as etapas de lavagem.
    5. Seque o glycochip pelo ar.
      Nota: Glycochip deve ser verificado logo que possível. Mas se não for possível digitalizar imediatamente depois da coloração, glycochips pode ser armazenado em local fresco e seco na escuridão.

3. análise da matriz de glicano

  1. Digitalizar a matriz
    1. Deixe o glycochip na mesa até que ele atinja a temperatura ambiente no escuro. Ao mesmo tempo, ligue o scanner de slides e o laser (comprimento de onda de excitação de 633 nm).
    2. Segurando o microarray, deslize o glycochip na ranhura até que toque a parte de trás.
    3. Digitalizar o glycochip ("executar varredura fácil") e salvar a digitalização como um ". Arquivo TIFF".
  2. Quantificação de matriz
    1. Quantificar a matriz usando um sistema de análise de ScanArray. Aberto anteriormente imagens digitalizadas, clicando em "Arquivo" no "grupo configurar & arquivo" na janela principal (figura 1B-D)
    2. Carregar o modelo de arquivo correspondente matriz em formato de GAL (disposição dos glicanos impressas sobre a lâmina de vidro) (Figura 1).
    3. Ajustar o modelo GAL alinhando cuidadosamente a matriz (grades), com as manchas na imagem e iniciar a quantificação (Figura 1).
    4. Selecione os parâmetros de quantificação:
      • Tipo de quantificação: Quant fácil de executar.
      • Método de quantificação: fixa o círculo
      • Auto encontrar pontos: desmarque todas as opções
      • Método de normalização: LOWESS (localmente ponderada Scatter Plot suavização).
    5. Salvar os dados quantificados como ". Arquivo CSV"(Figura 1). Transferi dados para um arquivo de planilha comum usando o Microsoft Excel ou outro aplicativo apropriado.
    6. Use o intervalo interquartil (IQR) como o principal método estatístico: cálculo da mediana (quartil 2) de todos os sinais para cada ligante e o desvio interquartil (percentis 75 e 25, ou quartis superiores e inferiores, Q3 e Q1, respectivamente).
    7. Execute exploração interativa de dados, usando um aplicativo Explorer de Clustering hierárquico.
    8. Uso de parâmetros de cluster: enlace média (UPGMA) e distância euclidiana como similaridade distância medida. Execute a clusterização hierárquica por linhas sem normalização.

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Representative Results

Aqui, apresentamos um resumo dos resultados representativos obtidos a partir da quantificação do repertório de anticorpos antiglicano natural em uma população de 20 camundongos BALB/c. O glycochips utilizado neste estudo continha 419 glicano diferentes estruturas. A maioria os glicanos foram sintetizados como -CH2CH2CH2NH2 Oespaçador-armado-glicosídeos, em vários casos como -CH2CH2NH2 ou NHCOCH -2NH2 glicosídeos. Todas as estruturas de glicano foram caracterizadas pela alta resolução (700 - ou 800 MHz) espectroscopia RMN, purificado e testado por HPLC, indicando sua > 95% de pureza. Nós determinamos simultaneamente IgM + IgG anticorpos antiglicano devido a uma restrição na quantidade de soro de rato. Na PGA, consideramos valores acima de 4.000 RFU como um sinal positivo de ligação do anticorpo (este valor é ~ 10% dos top glicanos RFU). Os resultados apresentados neste trabalho seguem a maioria das diretrizes para relatórios de dados microarray-based glicano39. Apenas 17% das estruturas de carboidratos demonstrou ≥4, RFU 000 no PGA (Figura 2, em vermelho). Maior parte o glicano estruturas expostas na glycochips não foram reconhecidos pelo repertório circulantes de anticorpos antiglicano de camundongos BALB/c (Figura 2, em azul e branco)28. O padrão conservado de anticorpos anticarboidratos naturais de BALB/c incluído 12 glicano diferentes especificidades, com intensidades de sinal médio muito elevado da ligação de anticorpos (≥ 10, 000 RFU tabela 1)28.

Figure 1
Figura 1 : Representação esquemática (não em escala) da configuração da matriz glicano, impressão e análise. (A) impresso "microchips" é desenvolvidos com uma biblioteca de 419 glicano diferentes estruturas, seguido da detecção com um anticorpo secundário fluorescente etiquetada apropriado. Cada slide contém 4 blocos de diferentes matrizes sub (em cores), repetidos 6 vezes. Cada submatriz único é formado por 112 glicano diferentes pontos (8 linhas × 14 colunas), incluindo controles. (B) um exemplo representativo das imagens obtidas microchip digitalização usando um scanner de fluorescência (terceira parte da imagem). (C) o processo de alinhar a "grade" de pontos em cada submatriz único (ajuste de modelo durante a quantificação). (D), a fluorescência é detectado para cada local e os resultados são transferidos para um arquivo de planilha comum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Repertório de anticorpos circulantes naturais do anti-hidrato de carbono de camundongos BALB/c. Amostras de soro de rato (01:20) foram incubadas com o glycochips e digitalizados usando um leitor de ScanArray. Os dados foram analisados com um sistema de análise de microarray e os resultados foram expressos em unidades de fluorescência relativo (RFU) como o média ± desvio absoluto mediano (MAD). As cores azuis e brancas representam sinais de ligação inferior a 4.000 RFU (fundo); cor vermelha representa os sinais ≥4, 000 RFU (ligação positiva). F: feminino; M: masculino (n = 20). Esta figura tem sido reproduzida de Bello-Gil, d. et al. 28. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Glicano
ID (#)		 Estrutura Nome comum Mediana e MAD como RFU Número de ratos mostrando ≥4000 RFU (%)
60 6-O-Su-Galβ-spb 61113 1156 100
271 Galβ1-6Galβ1-4Glcβ-sp 53622 1934 100
802 Galβ1-3GalNAc(furc) β-sp 51348 2324 100
176 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) Glcβ-sp 43008 9342 100
166 GlcAβ1-6Galβ-sp 39105 2993 85
150 3-O-Su-Galβ1-3GalNAcα-SP 37943 3232 100
437 GalNAcα1-3(Fucα1-2) Galβ1-3GalNAcβ-sp A(Type 4) 33886 3193 90
125 6-Bn-Galβ1-4GlcNAcβ-sp 32674 5389 95
154 3-O-Su-Galβ1-3GlcNAcβ-SP 32651 3954 100
177 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) GlcNAcβ-sp 32496 7215 100
287. 3-O-Su-Galβ1-3(Fucα1-4) GlcNAcβ-sp SuLeum 20063 4962 95
234 Galβ1-4(Fucα1-3) GlcNAcβ-sp Lex 13573 2635 80

Tabela 1: Top rank glicano estruturas reconhecidas por anticorpos naturais de camundongos BALB/c. Os glicanos com ligação sinaliza acima de 4.000 RFU em pelo menos 80% dos examinados ratos (n = 20). bsp significa espaçador aminoetilo, aminopropil ou glicil. cfuranose; todos os outros monossacarídeos estão em uma forma de pyranose; Resíduo de fuc tem L-configuração, todos os outros monossacarídeos - D-configuração. Esta tabela foi modificada de Bello-Gil, d. et al. 28.

Suplementares tabela 1: lista dos glicanos, sua vinculação ao naturais anticorpos circulantes (IgM + IgG) de camundongos BALB/c (n = 20), expressa em unidades de fluorescência relativo (RFU) como mediana ± MAD e o número de animais superior a cortar (≥4000 RFU). Esta tabela foi reproduzida de Bello-Gil, d. et al. 28. por favor clique aqui para baixar esta tabela

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Discussion

Microarrays de glicano tornaram-se ferramentas indispensáveis para o estudo de interações proteína-glicano40. O presente trabalho descreve um protocolo baseado em tecnologia de PGA para estudar o repertório da circulação de anticorpos anti-hidrato de carbono em camundongos BALB/c. Desde que o PGA oferece a possibilidade de um grande número de tela dos glicanos biologicamente desconhecidos, é uma descoberta extremamente conveniente ferramenta13,15,28. O método proposto oferece a possibilidade de medir, na mesma configuração experimental, centenas de glicano estruturas usando uma quantidade reduzida de amostra sorológica (50 µ l). Isto é especialmente crítico no caso de pequenos animais (pequeno volume de sangue circulante), ou quando é necessário extrair sangue várias vezes o mesmo animal experimental.

Demonstrámos que, como resultados representativos, que ratos geneticamente idênticos não devem ser considerados como equivalentes imunológicos; Porque eles desenvolvem diferentes padrões de anticorpos anti-hidrato de carbono naturais (apenas 12 glicano especificidades foram conservadas). Níveis serológicos para o resto do repertório de anticorpos anticarboidratos naturais variaram consideravelmente entre os animais examinados. Análise da microbiota do intestino de animais puras41 poderia explicar esta heterogeneidade42,,43,44,45,46. Se a produção de anticorpos antiglicano natural é mediada pela estimulação antigênica da microbiota, e isto é diferente entre ratos puras41, boa especificidade destes anticorpos não serão idêntica.

A principal desvantagem para o desenvolvimento do PGA é o acesso ao glicano bem-definidos estruturas40,47. Os glicanos produzidos em sistemas biológicos são heterogêneos40,,47,48, e sua biossíntese baseia-se na expressão diferencial de enzimas de hidrato de carbono, resultando em misturas heterogêneas de glycoforms, cada um com uma atividade fisiológica distintos47. A composição complexa e configuração dos glicanos presentes nos sistemas biológicos fazem suas produções desafiando40,,47,48. Juntamente com a síntese enzimática de quimioterapia, os glicanos isolados de fontes naturais vão continuar a ser a principal fonte dos glicanos para matrizes de desenvolvimento40. Sintético de baixo rendimento e o processo de purificação de complexos de glicoproteínas e glycosphingolipids tornar a produção eficiente dos glicanos em grande escala difícil de40,,47,48. Portanto, a disponibilidade e os preços dos glicanos continuam a ser uma condição muito limitante para expandir o uso da PGA como uma ferramenta de descoberta.

Além disso, o protocolo, passos críticos, principalmente relacionados com a distribuição correta das soluções (soro, anticorpos secundários) sobre a superfície de glycochip devem ser executados com cautela. A metodologia requer, pelo menos, 1 mL destas soluções, para embeber homogênea todas as áreas secas da superfície glycochip. Isto é crucial para obter diferenças mínimas entre repetições de glicano e também para evitar excessivo fundo durante a quantificação.

Apesar das limitações mencionadas, PGA é uma ferramenta muito sensível para abordagens relacionadas ao estudo de interações proteína-glicano40, ou para estudar o repertório de anticorpos antiglicano em uma determinada configuração experimental ou condição13, 15,28. Este estudo pode ser extrapolado para diferentes espécies (incluindo amostras humanas) 13,15,23,28, fornecendo uma metodologia versátil para identificar o repertório dos circulantes anticorpos anti-hidrato de carbono.

Prevemos também a potencialidade que esta abordagem pode trazer no diagnóstico precoce e tratamento derivado em algumas das condições patológicas onde anticorpos direcionados às estruturas glicano parecem desempenhar um papel importante.

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Disclosures

Nailya Khasbiullinae Alexey Nokel são empregados da Semiotik LLC, que é o fornecedor do glycochips utilizado neste estudo.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) conceder PI13/01098 do Instituto de saúde Carlos III, Ministério espanhol da saúde. DB-G foi beneficiado de uma posição de investigação pós-doutoramento financiada pela União Europeia sétimo programa-quadro (FP7/2007-2013) sob o 603049 de acordo de Grant (TRANSLINK). Trabalho de NB e NK, NS, foi apoiado por grant #14-50-00131 da Fundação de ciência russo. DB-G quer expressar sua gratidão a Marta Broto, J. Pablo Salvador e Ana Sanchis assistência técnica excelente e Alexander Rakitko para auxílio na análise estatística. Com o apoio do "Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d'Universitats eu Recerca del Departament d'Empresa eu Coneixement de la Generalitat de Catalunya (conceder número 2018 DI 021). Agradecemos a CERCA programa / Generalitat de Catalunya para apoio institucional.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).

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