Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Tryckta Glycan Array: En känslig teknik för analys av repertoaren av cirkulerande anti kolhydrat antikroppar i små djur

Published: February 14, 2019 doi: 10.3791/57662
Automatic Translation
*1, *2,3, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 2,4, 1, 1,5
1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Detta arbete visar potentialen i tryckta glycan array (PGA) teknik för analys av cirkulerande anti kolhydrat antikroppar i små djur.

Abstract

Repertoaren av cirkulerande anti kolhydrat antikroppar av en viss individ förknippas ofta med sin immunologiska status. Inte bara enskilda immun skick avgör framgång i kampen mot interna och externa potentiella hot signaler, utan också förekomsten av ett visst mönster av cirkulerande anti-glycan antikroppar (och deras serologiska nivå variation) kunde vara en betydande markör för uppkomsten och utvecklingen av vissa sjukdomstillstånd. Här, beskriver vi en tryckt Glycan Array PGA-baserad metodik som ger möjlighet att mäta hundratals glycan mål med mycket hög känslighet; använder en minimal mängd prov, som är en vanlig begränsning närvarande när små djur (råttor, möss, hamster, etc.) används som modeller till adress aspekter av mänskliga sjukdomar. Som ett representativt exempel på detta synsätt visar vi resultat från analysen av repertoaren av naturliga anti-glycan antikroppar hos BALB/c-möss. Vi visar att varje BALB/c mus deltog i studien, trots att genetiskt identiska och underhållna på samma villkor, framkallar ett visst mönster av naturliga anti kolhydrat antikroppar. Detta arbete hävdar att utöka användningen av PGA-teknik för att undersöka repertoar (särdrag) och nivåerna av cirkulerande anti kolhydrater antikroppar, både i hälsa och under alla sjukdomstillstånd.

Introduction

Antikroppar spelar en central roll i vårt försvar mot invaderande patogener genom att direkt neutralisera virus1,2 och bakterier2,3, genom att aktivera komplement system4,5 och förbättring av fagocytos6. Dessutom är de väsentliga delarna i cancer inriktning och eliminering av maligna celler7och homeostas underhåll8,9.

Störningar i immunförsvaret kan resultera i autoimmuna och inflammatoriska sjukdomar10 och cancer11. Alla dessa sjukdomstillstånd kräver helst en snabb diagnos för en effektiv behandling. Vid autoimmuna sjukdomar är serologiska förekomsten av autoantikroppar i de flesta fall en prediktor för diagnostik av autoimmunitet10,12. Dessa antikroppar reagerar med cellytan och extracellulära autoantigener och, de är ofta närvarande i många år innan presentationen av autoimmun sjukdom10,12. Immunförsvar och cancer också diagnosen blodprover att antingen mäta nivån på immun element såsom antikroppar eller deras funktionella aktiviteten11.

Identifiering av repertoaren av cirkulerande antikroppar och deras serologiska nivåer är av största vikt att ställa en prognos och utvärdera utvecklingen av samtliga nämnda patologiska villkor. Vi har tidigare visat potential PGA teknik för analys av cirkulerande antikroppar i olika djurarter13–16, minimera användningen av stora volymer av serologiska prover, undvika problemet i samband med antikroppar korsreaktivitet17 och tillåter hög genomströmning profilering av en bred repertoar av antikroppar15.

Glycan-baserade immunanalyser är främst betingade, bland andra faktorer, av ursprung och produktion av kolhydrater, som bestämmer affinitet och bindning av ligander15,18,19,20 ,21. Glycan-baserade immunanalyser kan utvecklas i suspension (mikrosfärer)15,21,22 eller platt-aktiverat ytor15,21,22, 23,24. Sist inkluderar ELISA (den mest konventionella metoderna) och PGA. Det finns inte mycket data som jämför dessa metoder i samma experimentella inställning15,25,26,27. Vi har tidigare jämfört effekten och selektivitet av dessa immunanalyser att profil anti-glycan antikroppar i enskilda humanplasma prover15. För vissa antikroppar såsom dessa inriktningsgrupp med anti-A/B blod, alla immunanalyser kunde upptäcka dem med statistisk signifikans och de korrelerade positivt med varandra15,18,21. Samtidigt anti-P1 antikroppar upptäcktes primärt av PGA med högsta diskriminerande effekt, och det fanns ingen korrelation i de avgöranden som fattas av de olika glycan-baserade immunanalyser15,18, 21. dessa skillnader mellan metoderna var främst relaterade till antikropp/antigen-förhållande och glycan orientering15. ELISA och fjädring matriser är mer mottagliga för ospecifik bindning än PGA eftersom det finns ett överskott av antigen över antikroppar i dessa metoder15. Dessutom är glycans i PGA orientering mer begränsat än i ELISA och fjädring matriser15. ELISA är praktiskt när studien omfattar en begränsad panel av glycans. Tillsammans med fjädring matriser erbjuder ELISA större flexibilitet när det gäller assay omkonfigurering. PGA är exceptionellt bekväm för upptäckt metoder15,18,21,28. Trots dessa tydliga fördelar och nackdelar, kunde de tre nämnda immunanalyser användas för att studera olika aspekter av glycan-antikropp interaktioner. Det slutliga målet för studien är den som kommer att vägleda valet av den mer lämplig metoden.

Nuvarande arbete syftar till att utvidga användningen av PGA teknik för analys av repertoaren av cirkulerande anti-glycan antikroppar i små djur. Som representativa resultat presenterar vi här ett detaljerat protokoll för att bedöma repertoaren av naturliga anti kolhydrat antikroppar i vuxna BALB/c-möss av PGA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Glycochips produktion

  1. Microarray förberedelse
    1. Skriv ut glycans (50 mM) och polysackarider (10 µg/mL) i 300 mM fosfat buffrad saltlösning (PBS, pH 8,5) på 6 replikerar på N-hydroxysuccinimide-derivatized glasskivor, använda icke-kontakt robotic arrayer (släppa volym ~ 900 pL). Varje bild innehåller 4 olika block av sub matriser (figur 1A, i färger) upprepas 6 gånger. Varje sub matris bildas av 112 olika glycan ställen, inklusive kontroller (8 rader × 14 kolumner) (figur 1B).
      Obs: Glycan-relaterad information tillhandahålls i en kompletterande Tabell1. Glycan biblioteket som används för utskrift mikrochips är resultatet av en långsiktig syntetiska insats i IBCh-teamet; exempel på syntes beskrivs i relaterade publikationer29,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38. Glycan biblioteket ingår blodgruppsantigener och några av de mest frekvent förekommande terminal oligosackarider samt core motiv av däggdjur N - och O-länkade glykoproteiner och glykolipider, tumör-associerad kolhydrat antigener, och polysackarider från patogena bakterier.
    2. Inkubera bilder i fukt box (relativ luftfuktighet ~ 70%) vid rumstemperatur (25 ° C) för 1 h.
    3. Blockerar microarrays: Inkubera bilderna för 1,5 h med blockerande buffert vid rumstemperatur (100 mM borsyra, 25 mM etanolamin, 0,2% (v/v) Tween-20 i ultrarent vatten).
    4. Tvätta glycochip med ultrarent vatten och torka den med flyg.
  2. Glycochip kvalitetskontroll
    1. Analysera två microarrays från varje sats med 1mg/mL lösning av komplexa immunglobulin preparat (CIP, som innehåller IgG, IgM och IgA), 10 µg/mL lösning av biotinylerade get anti-humana immunglobuliner som en sekundär antikropp (IgM + IgG IgA), följt av 1 µg/mL lösning av motsvarande fluorescerande streptividin konjugatet (via protokoll som beskrivs nedan, se steg 2).
    2. Skanna och analysera de glycochips (se steg 3, analys av glycan array).
    3. Använd microarray batchar med intra - och inter - chip korrelation högre än 0,9.

2. Glycan Array teknik

  1. Förbereda följande aqueous lösningar (i ultrarent vatten) och förvara dem i rumstemperatur (25 ° C):
    • Buffert-1: 1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) i PBS, 1% (v/v) Tween-20 och 0,01% (w/v) NaN3
    • Buffert-2: 1% (w/v) BSA i PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 och 0,01% (w/v) NaN3.
    • Buffert-3: 0,1% (v/v) Tween-20 i PBS.
    • Buffert-4: 0,001% (v/v) Tween-20 i PBS.
  2. Glycochip och prov förberedelse
    1. Sätta förvaringsboxen med glasen på bordet tills de når rumstemperatur (25 ° C).
      Obs: Använda puderfria latexhandskar. Glycochip måste manipuleras av den nedre delen av glas bilden, där streckkoden är belägen. Streckkoden kommer att hjälpa dig att identifiera höger sida, att undvika kontakt med ytan där glycans skrivs ut.
    2. Öppna rutan, ta glycochip och placera den i inkubation kammaren (25 ° C), redan luftkonditionerade med våta filterpapper att hålla luftfuktigheten konstant inne i kammaren.
    3. Under tiden, späd möss serum med buffert-1 (1:20) i 1,5 mL rör. Homogenisera serum lösningen (5 s) med en vortex mixer.
      Obs: Den volym som behövs för att helt täcka en enda glycochip yta är ungefär 1 mL.
    4. Efter homogenisering, inkubera utspädda serumet vid 37 ° C i 10 min i ett vattenbad för att undvika immunglobulin aggregering. Centrifugera rören för 3 min vid 10 000 x g och 25 ° C, samla supernatanten och kassera utfällt material.
    5. Placera glycochip noga i inkubation kammaren. Inkubera det 15 min vid 25 ° C med 1 mL buffert-3 att undanröja kvarvarande material på ytan av glycochip.
    6. Håll glycochip i vertikal position och rewash det med några droppar buffert-3 med hjälp av en plast Pasteur-pipett. Ta försiktigt bort bufferten från glycochip yta med filterpapper.
  3. Reaktion: antikroppar bindande
    1. Placera glycochip i kammaren inkubation. Sprid det spädda serumprovet över glycochip ytan med hjälp av en mikropipett. Inkubera med orbital agitation (30 rpm) vid 37 ° C för 1,5 h. se till att alla torra område av glycochip yta är täckt av spädda serumprovet använder spetsen på pipetten.
    2. Ta bort någon överflödig prov och fördjupa glycochip för 5 min i buffert-3 vid 25 ° C. Sedan flytta glycochip till en behållare med buffert-4 (5 min) och slutligen tvätta (5 min) i glycochip med ultrarent vatten. Centrifugera i glycochip för 1 min på 175 x g och 25 ° C till avlägsna vätskan.
  4. Upptäckt: sekundär antikropp
    1. Placera glycochip i kammaren inkubation. Sprid över glycochip ytan en lösning (5 µg/mL) av geten antimus (IgG + IgM) konjugerat med biotin i buffert-2. Inkubera med orbital agitation (30 rpm) vid 37 ° C för 1 h.
    2. Ta bort den obundna fraktionen och upprepa steg för tvätt.
    3. Efter centrifugeringen, inkubera i glycochip i mörker vid 25 ° C i 45 min (30 rpm) med 2 µg/mL motsvarande fluorokrom-märkt streptividin lösningen (i buffert-2).
    4. I mörker, ta bort den obundna fraktionen och upprepa steg för tvätt.
    5. Torka glycochip genom luften.
      Obs: Glycochip ska skannas så snart som möjligt. Men om det är omöjligt att göra Skanna omedelbart efter färgning, glycochips kan lagras på en sval och torr plats i mörker.

3. analys av Glycan Array

  1. Skanna matrisen
    1. Lämna glycochip på bordet tills den når rumstemperatur i mörkret. På samma gång, slå på diascanner och laser (excitation våglängd av 633 nm).
    2. Håller microarray, Skjut glycochip i kortplatsen tills det vidrör ryggen.
    3. Skanna glycochip (”köra lätt scan”) och spara sökningen som en ”. TIFF ”-fil.
  2. Array kvantifiering
    1. Kvantifiera matrisen ScanArray analyssystem med. Öppna tidigare skannade bilder, genom att klicka på ”fil” i ”Konfigurera & fil gruppen” på fönstret Main (figur 1B-D)
    2. Ladda mallen motsvarande matris filen i GAL format (disposition av tryckta glycans i glas-bilden) (figur 1 c).
    3. Justera GAL mallen genom att noggrant justera arrayen (nät) med fläckar i bilden och initiera kvantifiering (figur 1 d).
    4. Välj parametrarna för kvantifiering:
      • Rapporteringsgräns typ: kör lätt Quant.
      • Rapporteringsgräns metod: fast cirkel
      • Auto hitta ställen: unclick alla alternativ
      • Normalisering metod: LOWESS (lokalt vägda Scatter Plot utjämning).
    5. Spara de kvantifierade uppgifter som ”. CSV-”fil (figur 1 d). Överföra dessa data till en gemensam kalkylbladsfil som Microsoft Excel eller ett annat lämpligt program.
    6. Använda interkvartilintervall (IQR) som den huvudsakliga statistiska metoden: beräkning av medianen (kvartil 2) av alla signaler för varje liganden och interquartile avvikelsen (75: e och 25: e percentilerna eller övre och nedre kvartiler Q3 och Q1, respektive).
    7. Utföra interaktiv utforskning av data med hjälp av en hierarkisk klustring Explorer programmet.
    8. Använd klustring parametrar: genomsnittliga koppling (UPGMA) och euklidiska avstånd som likheten avstånd åtgärd. Utföra hierarkisk klustring av rader utan normalisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här presenterar vi en sammanfattning av representativa resultat från kvantifiering av repertoaren av naturliga anti-glycan antikroppar i en population av 20 BALB/c-möss. Den glycochips som används i denna studie innehöll 419 olika glycan strukturer. De flesta glycans var syntetiseras som -CH2CH2CH2NH2 spacer-beväpnade O-glykosider, i flera fall som -CH2CH2NH2 eller -NHCOCH2NH2 glykosider. Alla glycan strukturer präglades av hög upplösning (700 - eller 800 MHz) NMR spektroskopi, renat och testats av HPLC, som anger deras > 95% renhet. Vi har samtidigt bestämt IgM + IgG anti-glycan antikroppar på grund av en begränsning av mängden mus serum. I PGA ansåg vi värden över 4.000 RFU som en positiv signal av antikropp bindande (detta värde är ~ 10% av den övre glycans RFU). De resultat som presenteras i detta arbete följer de flesta av riktlinjerna för rapportering glycan microarray-baserade data39. Endast 17 procent av kolhydrater strukturer visat ≥4, 000 RFU i PGA (figur 2, i rött). De flesta av de glycan strukturerna som exponeras i glycochips inte var erkänns av repertoaren av cirkulerande anti-glycan antikroppar hos BALB/c-möss (figur 2, i blått och vitt)28. Det bevarade mönstret av naturliga anti kolhydrat antikroppar av BALB/c ingår 12 olika glycan särdrag, med mycket hög median signal intensiteter av bindande antikroppar (≥10, 000 RFU tabell 1)28.

Figure 1
Figur 1 : Schematisk representation (inte på skala) av den glycan matriskonfigurationen, utskrift och analys. (A) tryckt mikrochips är utvecklade med ett bibliotek av 419 olika glycan strukturer, följt av att upptäcka med en lämplig fluorescently märkt sekundär antikropp. Varje bild innehåller 4 olika block av sub matriser (i färger), upprepas 6 gånger. Varje sub matris bildas av 112 olika glycan ställen (8 rader × 14 kolumner), inklusive kontroller. (B) ett representativt exempel på bilderna framställs mikrochip skanning med hjälp av fluorescens skanner (tredje delen av bilden). (C) processen för att justera ”nätet” för att fläckar i varje enda sub array (mall justering under kvantifiering). (D), fluorescensen identifieras för varje plats och resultat överförs till en gemensam kalkylbladsfil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Repertoar av naturliga cirkulerande anti kolhydrat antikroppar av BALB/c möss. Mus serumprover (1:20) inkuberades med glycochips och skannats med en ScanArray läsare. Data analyserades med en microarray analyssystem och resultaten uttrycktes i relativa fluorescens enheter (RFU) som median ± median absoluta avvikelsen (MAD). Blå och vita färgerna representerar bindande signaler lägre än 4.000 RFU (bakgrund); röd färg representerar signaler ≥4, 000 RFU (positiv bindande). F: kvinna; M: manliga (n = 20). Denna siffra har återgivits från Bello-Gil, D. et al. 28. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Glycan
ID (#)		 Struktur Gemensamma namn Median och MAD som RFU Antal möss visar RFU ≥4000 (%)
60 6-O-Su-Galβ-spb 61113 1156 100
271 Galβ1-6Galβ1-4Glcβ-sp 53622 1934 100
802 Galβ1-3GalNAc(furc) β-sp 51348 2324 100
176 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) Glcβ-sp 43008 9342 100
166 GlcAβ1-6Galβ-sp 39105 2993 85
150 3-O-Su-Galβ1-3GalNAcα-SP 37943 3232 100
437 GalNAcα1-3(Fucα1-2) Galβ1-3GalNAcβ-sp A(Type 4) 33886 3193 90
125 6-Bn-Galβ1-4GlcNAcβ-sp 32674 5389 95
154 3-O-Su-Galβ1-3GlcNAcβ-SP 32651 3954 100
177 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) GlcNAcβ-sp 32496 7215 100
287 3-O-Su-Galβ1-3(Fucα1-4) GlcNAcβ-sp SuLeen 20063 4962 95
234 Galβ1-4(Fucα1-3) GlcNAcβ-sp Lex 13573 2635 80

Tabell 1: Top rank glycan strukturer erkänns av naturliga antikroppar hos BALB/c-möss. Glycans med bindande signaler över 4.000 RFU i minst 80% av undersökta möss (n = 20). binnebär sp aminoethyl, aminopropyl eller glycyl spacer. cfuranose; alla andra monosackarider är i en pyranose form; FUC rester har L-konfiguration, alla andra monosackarider - D-konfiguration. Den här tabellen har ändrats från Bello-Gil, D. et al. 28.

Kompletterande Tabell1: lista över glycans, deras bindning till naturliga cirkulerande antikroppar (IgM + IgG) BALB/c-möss (n = 20), uttryckt i relativa fluorescens enheter (RFU) som median ± MAD, och antalet djur som överstiger avskurna ()≥4000 RFU). Denna tabell har återgivits från Bello-Gil, D. et al. 28. vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Glycan microarrays har blivit oumbärliga verktyg för att studera protein-glycan interaktioner40. Den nuvarande arbetet beskriver ett protokoll baserat på PGA-teknik för att studera repertoaren av cirkulerande anti kolhydrat antikroppar hos BALB/c-möss. Sedan PGA erbjuder möjligheten att skärmen stora mängder biologiskt okänd glycans, är det en exceptionellt bekväm upptäckt verktyg13,15,28. Den föreslagna metoden erbjuder möjligheten att mäta, i samma experimentella inställning, hundratals glycan strukturer med en reducerad mängd serologiska prov (50 µL). Detta är särskilt viktigt när det gäller små djur (liten cirkulerande blodvolym), eller när det är nödvändigt att extrahera blod flera gånger från samma experimentella djur.

Vi visat, som representativa resultat, att genetiskt identiska möss inte bör anses immunologiska medel; eftersom de utvecklas olika mönster av naturliga anti kolhydrat antikroppar (endast 12 glycan särdrag var bevarad). Serologiska nivåer för resten av repertoaren av naturliga anti kolhydrat antikroppar varierade avsevärt mellan de undersökta djur. Analys av tarmfloran inavlade djur41 kunde förklara denna heterogenitet42,43,44,45,46. Om produktionen av naturliga anti-glycan antikroppar medieras av antigen stimulering av bakterieflora, och detta skiljer bland inavlade möss41, är fina specificitet av dessa antikroppar inte identiska.

Den största nackdelen för PGA utveckling är tillgång till väldefinierade glycan strukturer40,47. Glycans produceras i biologiska system är heterogena40,47,48och deras biosyntes bygger på differentiell uttrycket av kolhydrat enzymer, vilket resulterar i heterogena blandningar av glycoforms, var och en med en distinkt fysiologisk aktivitet47. Den komplexa sammansättningen och konfigurationen av glycans som är närvarande i de biologiska systemen göra deras produktioner utmanande40,47,48. Tillsammans med kemo-enzymatisk syntes, kommer att glycans isolerade från naturliga källor fortsätta att vara den huvudsakliga källan av glycans för matriser utveckling40. Låg syntetiska avkastning och komplexa reningsprocessen från glykoproteiner och glykosfingolipider gör effektiv produktion av glycans i stor skala svårt40,47,48. Därav, tillgängligheten och priserna på glycans fortsätta att vara ett mycket begränsande villkor att utöka användningen av PGA som ett upptäckt verktyg.

Dessutom inom protokollet, ska kritiska steg främst avser rätt distribution av lösningar (serum, sekundära antikroppar) över glycochip yta utföras med försiktighet. Metoden kräver, minst, 1 mL av dessa lösningar, att likartad suga alla torra områden på den glycochip ytan. Detta är avgörande att få minimala skillnader mellan glycan replikerar och också undvika överdriven bakgrund under kvantifieringsgränsen.

Trots de nämnda begränsningarna är PGA ett mycket känsligt verktyg för metoder relaterade till studera protein-glycan interaktioner40eller att studera repertoaren av anti-glycan antikroppar i en viss experimentella inställning eller villkor13, 15,28. Denna studie kan extrapoleras till olika arter (inklusive mänskliga prover) 13,15,23,28, som ger en mångsidig metod för att identifiera repertoaren av cirkulerande anti kolhydrat antikroppar.

Vi räknar också potentialitet som detta tillvägagångssätt kan sätta i tidig diagnos och härledda behandling i några patologiska tillstånd där antikroppar riktade till glycan strukturer verkar spela en viktig roll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nailya Khasbiullinaoch Alexey Nokel är anställda av Semiotik LLC, som är leverantör av den glycochips som används i denna studie.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av ”Fondo de Investigaciones Sanitarias” (FIS) bevilja PI13/01098 från Carlos III Health Institute, spanska hälsoministeriet. DB-G var gynnats av en postdoktoral forskartjänst som finansieras av Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt Grant avtal 603049 (TRANSLINK). NK, NS, och NB arbete stöddes av grant nr 14-50-00131 ryska Science Foundation. DB-G vill uttrycka sin tacksamhet till Marta Broto, J. Pablo Salvador och Ana Sanchis för utmärkt teknisk assistans och Alexander Rakitko för bistånd i statistisk analys. Med stöd av den ”Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d'Universitats jag Recerca del Departament d'Empresa jag Coneixement de la Generalitat de Catalunya (tilldela 2018 DI 021). Vi tackar CERCA programmet / Generalitat de Catalunya för institutionellt stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus. Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).
  2. Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases. Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).
  3. Bebbington, C., Yarranton, G. Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects. Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).
  4. Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. Janeway's Immunobiology. , 7th, Garland Science. New York. 61-80 (2008).
  5. Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies. Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).
  6. Borrok, M. J., et al. Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding. MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).
  7. Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. Antibody-based immunotherapy of cancer. Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).
  8. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).
  9. Prechl, J. A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network. Clin Transl Immunology. 6 (2), e131 (2017).
  10. Vojdani, A. Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases. Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).
  11. Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis. Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).
  12. Suurmond, J., Diamond, B. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity. J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).
  13. Bovin, N., et al. Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies? Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).
  14. de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species. Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).
  15. Pochechueva, T., et al. Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies. Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).
  16. Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution. Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).
  17. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).
  18. Jacob, F., et al. Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array. Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).
  19. Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time. ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).
  20. Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies. J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).
  21. Pochechueva, T. Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling. Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).
  22. Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating. Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).
  23. Huflejt, M. E. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges. Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).
  24. Buchs, J. P., Nydegger, U. E. Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies. J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).
  25. de Jager, W., Rijkers, G. T. Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison. Methods. 38 (4), 294-303 (2006).
  26. Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins. Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).
  27. Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  28. Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals. Front Immunol. 8, 1449 (2017).
  29. Pazynina, G., et al. Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies. Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).
  30. Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system. Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).
  31. Ryzhov, I. M., et al. Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies. Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).
  32. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides. Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).
  33. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides. Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).
  34. Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments. Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).
  35. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc. Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).
  36. Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
  37. Pazynina, G. V., et al. Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block. Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).
  38. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  39. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).
  40. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. Chemistry of natural glycan microarrays. Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).
  41. Hoy, Y. E., et al. Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time. PLoS One. 10 (11), e0142825 (2015).
  42. D'Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).
  43. Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist's opinion. Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).
  44. Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues. Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).
  45. Bos, N. A., et al. Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet. Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).
  46. van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning. J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).
  47. Krasnova, L., Wong, C. H. Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis. Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).
  48. Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., et al. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. Essentials of Glycobiology [Internet]. Varki, A., et al. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). Chapter 54 2015-2017 (2017).

Tags

Immunologi och infektion fråga 144 mönster av naturliga antikroppar cirkulerande anti-glycan antikroppar glycan särdrag glycochips tryckt glycan array PGA möss
Tryckta Glycan Array: En känslig teknik för analys av repertoaren av cirkulerande anti kolhydrat antikroppar i små djur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., … More

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter