Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

SiRNA نانوحبيبات بوساطة إسكات الجينات في قلب الزرد الكبار

Published: July 29, 2018 doi: 10.3791/58054
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine, State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Institute of Molecular Medicine, Peking University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Peking University

Summary

فإنه يظل تحديا كبيرا لوضع الشرطي الجينات-خروج المغلوب أو فعالية الجينات-ضربة قاضية في الأجهزة الزرد الكبار. هنا نحن تقرير وضع بروتوكول للمنفذ siRNA نانوحبيبات بوساطة إسكات الجينات في قلب الزرد الكبار، مما يوفر طريقة فقدان لوظيفة جديدة لدراسة الأجهزة الكبار في الزرد والكائنات الأخرى في النموذج.

Abstract

الثدييات لديها قدرة محدودة للغاية لتجديد القلب بعد احتشاء عضلة القلب. من ناحية أخرى، تجدد الزرد الكبار قلبها بعد بتر ابيكس أو كريوينجوري، مما يجعل من الكائن حي نموذجا هاما لدراسة تجديد القلب. ومع ذلك، قيدت عدم وجود أساليب فقدان لوظيفة لأجهزة الكبار ثاقبة الآليات الأساسية لإنعاش القلب. تدخل الجيش الملكي النيبالي عبر مختلف نظم إيصالها أداة قوية لإسكات الجينات في خلايا الثدييات والكائنات نموذج. وقد أبلغنا سابقا أن جسيمات نانوية siRNA مغلفة بنجاح إدخال الخلايا وينتج ضربة قاضية خاصة بالجينات ملحوظا في قلب الكبار الزرد تجديد. نقدم هنا، بروتوكول بسيطة وسريعة وفعالة لإيصال ديندريمير بوساطة siRNA وإسكات الجينات في قلب الكبار الزرد تجديد. هذا الأسلوب يوفر نهج بديل لتحديد وظائف الجينات في الأجهزة الكبار في الزرد، ويمكن تمديدها إلى نموذج الكائنات الحية الأخرى، وكذلك.

Introduction

احتشاء عضلة القلب قد أصبح يشكل تهديدا رئيسيا لصحة، المؤدية إلى عبئا اقتصاديا هائلا حول العالم1. فشل قلب الثدييات الكبار لإنعاش وتجديد cardiomyocytes المفقودة على نطاق عيانية بعد الإصابة، مما يؤدي إلى تشكيل ندبة الأنسجة وقصور القلب اللاحقة. خلافا للثدييات، الزرد قادرة على إنعاش القلب، أساسا من خلال انتشار احتشاء عضلة القلب قوية بعد أنواع مختلفة من إصابات القلب، جعله كائن نموذج مثالي للتحقيق في الآليات الجزيئية لإنعاش القلب 2،3،4،،من56،،من78. فك رموز الآليات الذاتية الكامنة وراء تجديد القلب الزرد مجالاً مثيرة للبحث في البحث عن رواية الاستراتيجيات العلاجية لتحسين قلب الإنسان التجديد9.

تتوفر أساليب التلاعب بالجينات في الزرد. وتتألف هذه من مورفولينوس (MO) التي تستخدم أيضا على نطاق واسع في الفرخ، الضفادع والثدييات إلى جانب في الزرد10،11،،من1213. وقد مو كفاءة ضربة قاضية للتعبير الجيني المستهدف في فنلندا الزرد الكبار والمخ، وشبكية العين14،،من1516،17،،من1819. الأحماض النووية مؤمنة (LNA) هو آخر اليغنوكليوتيد الاصطناعية المستخدمة نهدم التعبير الجيني الذاتية ليس فقط في الأجنة الزرد ولكن أيضا في أجهزة الحيوان البالغين20،،من2122، 23 , 24-ومع ذلك، لا يزال انعدام أساليب فقدان لوظيفة فعالة لقلوب الكبار عقبة في دراسة الآليات الجزيئية لتجديد الجهاز. في مثبطات الحاضر، جزيء صغير أو التعبير المحورة وراثيا من طفرات السلبية المهيمنة تستخدم أساسا لمنع وظيفة الجينات معينة أو مسار لدراسة وظيفتها في الزرد الكبار قلب التجديد25،26 ،27. ومع ذلك، ليس كل الجينات أو مسارات إشارات قابلة للتطبيق لهذه الأساليب.

الكشف التدخل الصغيرة (سيرناس) تستخدم على نطاق واسع لتحليل الخسارة من الدالة في خلايا الثدييات والأجنة من طراز الكائنات الحية، فضلا عن أجهزة الكبار لنماذج الدراسات الإكلينيكية في الحيوان28،،من2930 , 31 , 32-سيرناس قد استخدمت فعلياً لإسكات الجينات في أورام33،،من3435 وفي cardiomyocytes36،،من3738،39 ،40 عبر مختلف نظم إيصالها. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير كفاءة نانوحبيبات مغلفة siRNA إسكات الجينات في قلب الكبار تجديد استخدام عدة جسيمات نانوية مختلفة41،،من4243، توفير أداة جديدة الدراسات الفنية للجينات في الأجهزة الزرد الكبار. تستند جهودنا السابقة الدراسات42،،من4143، هنا نقدم بروتوكول بسيطة، وعملية، ولكن قوية لإسكات الجينات في قلب الكبار الزرد تجديد استخدام f-بامام-شماعة-R9 siRNA ديندريميرس. Aldh1a2 (ألدهيد نازعة 1، أفراد الأسرة A2) الجينات upregulated بعد الزرد ابيكس الاستئصال والاجتثاث من Aldh1a2 حظر تجديد القلب44. ونحن هنا نلقي جين aldh1a2 كمثال لاختبار كفاءة ضربة قاضية الجيني بحقن siRNA مغلفة نانوحبيبات وساطة. يتضمن هذا البروتوكول إجراء لاستئصال القلب الزرد والتوليف الكيميائي لجسيمات نانوية وأسلوب تسليم على جسيمات نانوية siRNA مغلفة في قلب الزرد الكبار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

استخدام كافة الإجراءات الحيوان الزرد بروتوكول أقرته لجنة الاستخدام في جامعة بكين، والذي الكامل معتمدة من قبل جمعية التقييم والاعتماد لرعاية الحيوانات المختبرية ورعاية الحيوان المؤسسية.

1-إعداد حل تريكيني

  1. لإعداد حل الأسهم تريكيني، إضافة مسحوق ميثانيسولفوناتي 3-أمينوبينزواتي إيثيل 400 ملغ إلى 97.9 مل مقطر من الماء ثم قم بإضافة 2.1 مل من 1 "م تريس" (pH 9.5) لضبط درجة الحموضة إلى ~ 7. مخزن الحل الأسهم عند 4 درجة مئوية.
  2. لإعداد حل العامل تريكيني، إضافة 4.2 مل تريكيني حل الأسهم إلى 100 مل ماء نظام المياه.

2-الكبار الزرد بتر البطين

  1. إعداد الأدوات والمواد للجراحة التي تشمل قطعة من الأسفنج، طبق بيتري مليئة تريكايني يعمل الحل، ماصة بلاستيكية، ستيريوميكروسكوبي، وهما الملقط حادة، مقص إيريديكتومي، والكوع ملاقط (الشكل 1).
  2. إعداد أخدود صغير من حجم 4 × 0.5 سم و 0.5 سم في العمق على الأسفنج بعقد في الزرد أثناء جراحة استئصال البطين.
  3. تعبئة أملاح دبابة 3 ل الزرد مع نصف خزان المياه نظام الزرد التي يتم إجراؤها باستخدام البحر 60 مغ/لتر في dH2س لاسترداد الأسماك المصابين.
  4. تخدير السمك في 10 سم طبق بيتري مع الحل تريكايني حتى حركات جيل إنقاص واحد في الثانية الواحدة، والحفاظ على الأسماك لمالا يقل عن 30 ثانية لضمان أن يتم تخديره تماما.
  5. نقل السمك أنيسثيتيزيد مع ملاقط الكوع للاخدود في جانب البطني اسفنجة رطبة حتى. موقع بصريا هامش قلب ينبض، وثم حدد موقع القلب تحت ستيريوميكروسكوبي.
  6. استخدام مقص iridectomy جعل شق صغير حوالي 1 مم، التي تخترق الجلد والعضلات، والدموع بعناية الطبقة الظهارية فضي من كيس التامور مع نصائح الملقط الوصول إلى القلب. لا تدرج الملقط عميقة جداً في التجويف تجنب الإصابة القلب.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، نأخذ في الاعتبار لتجنب نزيف واسعة النطاق. استبعاد الأسماك من التجربة إذا كان يحدث نزيف واسعة النطاق، نظراً للنزيف ناجم أساسا عن الضرر العرضي للقلب وذلك سيؤدي إلى نتائج مضللة.
  7. كشف في البطين بلطف عقد ذروتها مع الملقط حادة باستخدام اليد غير المهيمنة أو بتطبيق ضغط البطن لطيف. ثم باليد الأخرى، إزالة ~ 20 ٪ طين في ذروة استخدام مقص iridectomy.
    ملاحظة: لا نزيف واسعة ينبغي أن تحدث في هذه المرحلة.
  8. استخدام منديل مبللة لتغطية الشق، كما تنزف الجروح غزارة ل s 15 – 45 قبل تخثر الدم، ومن ثم وضع الأسماك مرة أخرى إلى الخزان بالماء النظام.
    ملاحظة: ليس ضروريا خياطة الشق.
  9. تأكد من أن السمك يستعيد الحركات الخيشومية داخل 1 دقيقة وثم يستأنف السباحة. إذا كانت الأسماك لا تظهر الحركات الخيشومية بعد 50 s في الماء، وتسهيل ذلك بالتدفق المياه في الخياشيم استخدام ماصة بلاستيكية حتى يستأنف الأسماك التهوية النشطة.
  10. الحفاظ على الأسماك في نظام سلة المحذوفات بعد بتر البطين.
    ملاحظة: لا يهتم الخاصة ضرورية بالمقارنة مع الأسماك العادية. معدل الوفيات من بتر البطين الزرد الكبار هو حوالي 5 – 10%. وفاة ما يقرب من جميع يحدث في غضون 24 ساعة بعد الجراحة.

3-إعداد جسيمات نانوية siRNA مغلفة

  1. توليف بام و4-ربط-R9 dendrimer.
    ملاحظة: توليف بام و4-ربط-أنجز R9 dendrimer المواد كما هو موضح سابقا37 مع إدخال بعض التعديلات عليها. تم تخفيض طول α، ديبيريديل ω ديسولفيدو البولي إيثيلين غليكول (Py-شماعة-Py) إلى وزن الجزيئي من ألف إلى أقصى حد تغليف سيرناس (الشكل 2ب).
  2. جاف 10 مغ لب سيستاميني G4.0 بولياميدواميني (يسمى بامام) باستخدام مجفف الفراغ عند 45 درجة مئوية ح 1 وحل ثم بامام في مخزنة الفوسفات المالحة 2 مل دولبيكو (دببس، حل متوازن ملح يستخدم لمجموعة متنوعة من التطبيقات ثقافة الخلية).
  3. حل 1.7 ملغ tris(2-carboxyethyl) الفوسفين (تسيب) في 1 مل دببس، خلط مع الحل بامام الذي أعد في 3.2 وتترك في درجة حرارة الغرفة مع التحريك لطيف ح 8.
    ملاحظة: تسيب عشرة إضعاف في نسبة المولى الزائدة إلى روابط ثنائي كبريتيد بامام.
  4. إزالة تسيب المفرط عن طريق أولترافيلتريشن. إضافة دببس إلى خليط بامام-تسيب أعلاه للوصول إلى حجم 10 مل والحل هو تحويلها إلى أنبوب أولترافيلتريشن (وزن جزيئي قطع) موكو كاتشين 3. بعد استخدام الطرد المركزي في ز 3,000 لمدة 15 دقيقة، تجاهل الحل في أنبوب جمع. إضافة دببس إلى جهاز تصفية إلى 10 مل وماصة العينة بلطف عدة مرات والطرد المركزي مرة أخرى. كرر هذه الخطوة 4 مرات. وبعد الترشيح الأخير، نضح العينة من جهاز عامل التصفية.
    ملاحظة: المنتج من هذه الخطوة هو تخفيض بامام (يطلق عليها و PAM4).
  5. حل 14 ملغ Py-شماعة-Py في 1 مل دببس، مزيج مع الحل و PAM4 واتركه مع التحريك لطيف في درجة حرارة الغرفة ح 3. قم بإزالة المفرطة Py-شماعة-أي خطوة أولترافيلتريشن كما هو موضح في 3-4. وبعد الترشيح الأخير، نضح العينة من جهاز عامل التصفية.
    ملاحظة: المنتج وهو اسمه و-PAM4-شماعة-Py. إذ تبلغ Py-شماعة-أي بنسبة المولى لجماعات ثيول في واو-PAM4.
  6. أنهى حل 6.4 ملغ السيستين R9 الببتيد (Ac-كرررررررر-NH2) في 1 مل دببس، خلط مع و-PAM4-شماعة-Py ويقلب بلطف ل 8 ساعات في درجة حرارة الغرفة. تنقية المنتج النهائي، تسمى واو-PAM4-شماعة-R9، خطوة أولترافيلتريشن كما هو موضح في 3-4 فيما عدا أنه يتم تغيير دببس للمياه. ليوفيليزي المنتج باستخدام فراغ تجميد مجفف.
    ملاحظة: يتم تخزين المنتجات في 3.5 و 3.6 قبل ليوفيليزيشن في ℃-20 لمدة شهر واحد على الأقل. بعد ليوفيليزيشن و-PAM4-شماعة-R9، يتم تخزين العينات في ℃-20 لمدة شهرين على الأقل.
  7. لتحديد درجة التعديل شماعة والببتيد، حل 5 ملغ و-PAM4-شماعة-Py في د2س (أكسيد الديوتيريوم) وتحويلها إلى أنبوب عينة الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي). إجراء التحليل الطيفي الرنين المغناطيسي ح 1 في 400 ميجاهرتز، وتحليل البيانات باستخدام الرنين المغناطيسي بيانات تحليل البرنامج37.
    ملاحظة: الممثل بامام قمم (-NCH2CH2CO-) على وجه التحديد، وقمم شماعة (-OCH2CH2-)، وقمم بقايا ارجينين (-HCCH2CH2CH2NH-) في الببتيدات من المتوقع أن يكون في النطاقات 2.4-2.6، 3.7-3.8 و 1.6 – 1.8 جزء في المليون، على التوالي. تحديد درجة التعديل شماعة و R9 بالنسبة بامام عن طريق حساب التكاملات قمم شماعة و R9 إلى قمم بامام. تعديل درجة الوتد 100 ٪ وكان التعديل R9 50 في المائة على الأقل. وتجري التحاليل الطيفية 1ح-الرنين المغناطيسي النووي في المرافق الأساسية للمؤسسة.
  8. حل أم4-ربط-R9 dendrimer مسحوق في برنامج تلفزيوني إلى 4 ملغ/مل وجعل مختبرين للحل للاستخدام مرة واحدة.
    ملاحظة: الحل ديندريمير يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل، دون تكرار التجميد والذوبان.
  9. حل سينين الأصباغ المسمى سيرناس (يطلق عليها Cy5-siRNA) أو Aldh1a2 siRNA أو siRNA سارعت الرقابة السلبية في الماء المقطر إلى 10 ميكرون.
    ملاحظة: استخدم سيرناس المسمى الأصباغ سينين لتقييم ما إذا كان يمكن إدخال siRNA نانوحبيبات مغلفة قلب الأسماك (الشكل 2أ-ب). يأخذ هذا البروتوكول aldh1a2 كجينات مثال لتحديد كفاءة إيصال siRNA مغلفة ديندريمير و-PAM4-شماعة-R9. تسلسل سيرناس،: Cy5-siRNA العقاقير حبلا: 5-أكجوجاكاكجووكجاجادتدت-3, siAldh1a2 العقاقير حبلا: 5 '-أووكاجاكاككجوجووككدتدت-3' وسارعت الرقابة السلبية siRNA العقاقير حبلا: 5 '-أكجوجاكاكجووكجاجادتدت-3'.
  10. إعداد الحل نانوحبيبات siRNA مغلفة ومزيج siRNA مع حجم متساو لحل ديندريمير، واحتضان إعداد العينة في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 20 الطازجة الحل نانوحبيبات siRNA قبل الاستخدام.
    ملاحظة: حجم مغلف siRNA نانوحبيبات الحل يعتمد على عدد الأسماك تسير بالحقن. على سبيل المثال، يعد الحل dendrimer ميليلتر 120 على الأقل (ميكس 60 ميليلتر siRNA الحل والحل dendrimer ميليلتر 60) لحقن الأسماك 10 (~ 10 ميليلتر كل الأسماك)، عد إلى فقدان الحل.

4-حقن جسيمات نانوية siRNA مغلفة في الكبار الزرد القلب

  1. كما هو موضح أعلاه، تعد قطعة من الأسفنج مع أخدود، طبق بيتري 10 سم مليئة بحل تريكيني ماصة بلاستيكية، ستيريوميكروسكوبي، ملاقط الكوع وحقنه الأنسولين (الشكل 1)، فضلا عن خزان أسماك مع نظام المياه للإسكان الأسماك بعد الحقن.
  2. تسمح الزرد المصابين أعد الخطوات 2.1 – 2.10 لاسترداد لمدة يوم واحد بعد بتر البطين، وثم تخدير السمك (أيام ما بعد بتر الأطراف) اتفاق دارفور للسلام 1 في حل تريكيني كما هو موضح في 2-4.
  3. نقل الأسماك أنيسثيتيزيد، والجانب البطني، إلى groove باسفنجة رطبة باستخدام الملقط الكوع. قم بتحديد موقع قلب ينبض تحت ستيريوميكروسكوبي.
  4. تحميل 10 ميليلتر من الحل نانوحبيبات siRNA مغلفة في محقن الأنسولين. تجنب فقاعات قدر الإمكان.
  5. شل الأسماك باستخدام الملقط الكوع برفق لعقد منطقة الصدر باليد غير المهيمنة. لا المشبك الأسماك مسرف.
    ملاحظة: الاحتفاظ في الاعتبار أن لا نزف واسع النطاق ينبغي أن تحدث أثناء الحقن.
  6. عقد حقنه الأنسولين شغلها في ~ 30° وحقن ~ 10 ميليلتر من الحل في تجويف الصدر باستخدام اليد الأخرى (تكميلية الشكل 1).
    ملاحظة: الحل تدفقات أحياناً من خلال الحقن، ولكن هذا لا يؤثر على أثر siRNA. يمكن أن يكون حقن محلول نانوحبيبات siRNA مرة واحدة في يوم لعدة أيام إلى شهر واحد، تبعاً لخطة تجريبية محددة. حقن أسماك بنوع واحد من siRNA في كل مرة. إذا كان أكثر من نوعين من siRNA تحتاج إلى أن حقن الأسماك واحدة، حقن نوع واحد من siRNA في كل مرة، وثم إدخال نوع آخر من siRNA ح 1 في وقت لاحق. في هذا البروتوكول، تم حقن نوع واحد فقط من siRNA للأسماك.
  7. نقل الأسماك إلى خزان المياه النظام.
    ملاحظة: من المتوقع الأسماك إعادة تشغيل التهوية داخل 1 دقيقة ومن ثم استئناف السباحة. حقن جسيمات نانوية siRNA مغلفة أو siRNA عادة لا يسبب الموت في الزرد الكبار.

5-جمع وتثبيت وتقييم كفاءة siRNA تسليم القلب

  1. إعداد 1 مل محلول بارافورمالدهيد 4% في أنبوب ميكروسينتريفوجي لكل مجموعة.
  2. تخدير السمك في حل تريكيني في الأيام المحددة بعد الحقن. ضع السمك سوبينيلي في الاخدود في اسفنجة رطبة. إجراء شق كبير في منطقة الصدر وفتح على نطاق واسع مع الملقط. قبضة المسالك إلى الخارج وسحب قلب كله بعناية مع الملقط.
  3. شطف القلب ببرنامج تلفزيوني وسرعة إزالة سائل إضافي مع منديل. وضع قلوب يصل إلى 10 في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مع بارافورمالدهيد 1 مل. بلطف قلب الأنبوبة عدة مرات، ويبقى بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  4. قياس كثافة fluorescence قلوب Cy5-سيرناس-حقن استخدام في فيفو التصوير النظام (تكميلية الشكل 2). استخدام قلوب الزرد 3 – 4 لكل مجموعة في هذه الدراسة.
  5. جبل قلوب ثابتة مع البارافين أو أكتوبر مجمع (تضمين المتوسطة "عينات الأنسجة المجمدة" لضمان درجة حرارة القطع الأمثل).

6-تقييم siRNA نانوحبيبات بوساطة إسكات الجينات

  1. إعداد الحاويات المعزولة وملاقط طويلة. صب في النتروجين السائل إلى ثلث حجم الحاوية.
  2. تخدير السمك في حل تريكايني في 2 اتفاق دارفور للسلام. تشريح القلوب كما هو موضح في 5-2، ثم قم بإزالة المسالك إلى الخارج والحديقة الشتوية.
    ملاحظة: الأسماك يمكن التعافي من عملية جراحية في يوم واحد وثم حقنه في اتفاق دارفور للسلام 1 مع أما سارعت مغلفة siRNA جسيمات نانوية (سينك) سلبية السيطرة أو aldh1a2 مغلفة siRNA جسيمات نانوية (siAldh1a2).
  3. نقل في البطينين في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل باستخدام الملقط وتغطي غطاء أنبوب فورا بوضع الأنبوب في حاوية معزول بالنتروجين السائل. تعويم أنابيب في النيتروجين السائل لدقيقة قليلة استخدام ملاقط طويلة لإزالة أنابيب من الحاوية.
  4. كرر الخطوات 6، 2 و 6-3 حتى يتم تجميع جميع البطينين. استخدام قلوب 6-10 لكل مجموعة.
  5. استخراج الجيش الملكي النيبالي إجمالي القلوب مع كاشف عزل الحمض النووي الريبي. تقييم مستويات تعبير الجينات الخاصة بكل منها بكمية RT-PCR باستخدام كبسولة تفجير "جابده f: جاتاكاكجاجكاككاجت"؛ جابده ص: جككاتكاجتكاكاتاكاكج؛ F: Aldh1a2 تجاجكجاجاجكاجكاجاجا؛ Aldh1a2 ص: تككاكجاجاجككتتاجتاجكا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتحديد كفاءة إنجاز siRNA dendrimer بوساطة، نحن مستأصل قمة البطين القلب الزرد، ثم حقن حوالي 10 ميليلتر من ديندريمير فقط (مجموعة صورية) أو Cy5 siRNA فقط (مجموعة عارية) وبامام-شماعة-R9 مغلفة ديندريمير إينترابليورالي Cy5-siRNA (مجموعة Cy5-siRNA)، على التوالي (الشكل 2أ-ب). إشارة الأسفار كان يمكن اكتشافها في قلوب حقن بتغليف ديندريمير Cy5-siRNA في 3 و 24 و 48 hpi (ساعات ما بعد الحقن)، في حين أنه لا يكاد يمكن اكتشافها في قلوب من مجموعات وهمية وعارية في hpi 48 (الشكل 2ج-د)، مما يوحي بأن ديندريمير وبامام-شماعة-R9 فعال يسهل إيصال سيرناس إلى قلب الزرد الكبار وهو مستقر لمدة يومين على الأقل.

للتحقيق في تأثير siRNA dendrimer مغلفة على إسكات الجينات، اخترنا aldh1a2 (إنزيم توليف حمض الريتينويك) كجينات مستهدفة، التي تم الإبلاغ عن المطلوب لتجديد القلب بعد بتر البطين44 . كما هو موضح في الشكل 3ألف، تم السماح باسترداد لمدة يوم واحد بعد بتر البطين الأسماك وميكروينجيكتيد ثم مع تغليف dendrimer siRNA. لقد وجدنا أن مستوى التعبير مرناً aldh1a2 انخفض في قلوب تعامل مع siAldh1a2 وبامام-شماعة-R9 dendrimer مغلفة بالمقارنة بتغليف dendrimer سارعت siRNA (سينك) في اتفاق دارفور للسلام 2 (الشكل 3ب)، مما يدل على أن تحقيق سيرناس dendrimer بوساطة وبامام-شماعة-R9 إسكات الجينات محددة في قلب الزرد الكبار.

Figure 1
الشكل 1 : جراحة القلب والصدر حقن الصكوك. صورة للأدوات المستخدمة لاستئصال البطين في قلب الزرد الكبار: الأسفنج مع أخدود وملاقط الكوع والملقط حادة، ومقص إيريديكتومي، ملاقط طويلة وحقنه الأنسولين المستخدمة لتسليم siRNA dendrimer مغلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : وبامام-شماعة-R9 ساعد dendrimer الإنجاز الفعال ل siRNA إلى قلب الزرد البالغين المصابين. مخطط (أ) التحقيق في كفاءة امتصاص Cy5-siRNA نانوحبيبات مغلفة في قلب الزرد الكبار بعد بتر البطين (اتفاق دارفور للسلام: أيام ما بعد بتر الأطراف؛ hpi: حقن بعد ساعات). (ب) تجميع ديندريمير وبامام-شماعة-R9 والتحضير لتغليف ديندريمير Cy5-siRNA. (ج) Cy5 fluorescence تصوير القلوب حقن ديندريميرس فقط (وهمية)، Cy5-siRNA فقط دون تغليف ديندريمير (عارية)، وتغليف ديندريمير fluorescence المسمى Cy5-siRNA (Cy5-siRNA) الكشف عن طريق التصوير فيفو في النظام، تبين أن إشارات الأسفار غير قابل للكشف تقريبا في مجموعات وهمية وعارية في hpi 48، بينما إشارات قوية الإبقاء في تغليف ديندريمير مجموعات Cy5-siRNA من 3 إلى 48 hpi. يظهر المقياس التعسفي من إشارات الأسفار من الضعفاء (أزرق) لقوى (أحمر). (د) القياس الكمي للأسفار Cy5-siRNA إشارات في قلوب يقيمها في فيفو التصوير النظام كما هو الحال في لوحة ج (* P < 0.05، * * * ف < 0.001؛ والبيانات يعني ± s.e.m.؛ وتحليل التباين أحادي الاتجاه متبوعاً بونفيروني للمقارنة متعددة الاختبارات؛ n = قلوب 3-4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : كفاءة siRNA إسكات aldh1a2 في قلب الزرد البالغين المصابين. (أ) نظام للتحقيق في تأثير إسكات الجينات aldh1a2 siRNA. قبكر (ب) يكشف عن أن aldh1a2 مرناً انخفض في قلوب siAldh1a2 نانوحبيبات مغلفة بالمقارنة مع تغليف نانوحبيبات siRNA سارعت القلوب (سينك). كان تطبيع مستوى التعبير مرناً aldh1a2 جابده (* * * ف < 0.001؛ والبيانات هي يعني s.e.m. ± مع إقران اختبار t للطالب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Figure 1
التكميلية الرقم 1: صور لحقن تجويف الصدر. (أ) تجويف الصدر في الأسماك الكبار في يوم 1 وظيفة البتر. (ب) ضخ siRNA نانوحبيبات مغلفة في تجويف الصدر. تغيير حجم أشرطة: 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Figure 2
التكميلية الرقم 2: كفاءة امتصاص Cy5-siRNA نانوحبيبات مغلفة في قلب الزرد الكبار يصب. (أ) تصوير الأسفار Cy5 القلوب حقن ديندريميرس فقط (وهمية)، siRNA Cy5 عارية دون تغليف ديندريمير (عارية)، وتغليف ديندريمير Cy5-siRNA تحت في فيفو نظام التصوير. مقياس التعسفي من إشارات الأسفار من الضعفاء (أزرق) قوية (أحمر). (ب) التحديد الكمي للأسفار Cy5-siRNA إشارات في قلوب تقاس في فيفو نظام كما هو الحال في الفريق بتصوير (NC: لا هامة مختلفة؛ البيانات يعني ± s.e.m.؛ وتحليل التباين أحادي الاتجاه متبوعاً بونفيروني لعدة اختبار المقارنة؛ n = قلوب 3-4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الزرد قادر تماما على تجديد مجموعة متنوعة من الأجهزة بما في ذلك في قلب الكبار5. بينما المعدلة وراثيا والوراثية أساليب متطورة لدراسة وظائف الجينات في أجنة الزرد، تزال تواجه المحققين مع المهمة الشاقة المتمثلة في توليد الآليلات متحولة الشرطي في الزرد45،46. وهكذا، كثيرا ما معدلة وراثيا المهيمنة-السلبية طفرات أو مثبطات جزيء صغير تستخدم بعنوان وظائف الجينات في الزرد الكبار الأجهزة25،،من2742. على مدى بضع سنوات، قمنا بتطوير أسلوب بديل لتحليل الخسارة من وظيفة الجينات في قلب الزرد الكبار باستخدام التسليم بوساطة نانوحبيبات siRNA والجينات إسكات4241،، 43. ويرد هنا، بروتوكول مفصل لهذا الأسلوب باستخدام siRNA dendrimer بوساطة الجينات إسكات في قلوب الزرد على وجه الخصوص وربما في الأجهزة الأخرى الزرد، بصفة عامة،.

لا يمكن إدخال في الخلايا بحد ذاته سبب لها شحنة سالبة جزيء siRNA وأن تتحلل بسهولة نوكلاس. مع مونو-تفريق الجزيئات وهياكل الانضباطي وخصائص، ديندريميرس وقد اعتبرت واعدة كما siRNA الناقلين 47. ديندريميرس بامام أطراف الموجبة الغنية والامينات التخزين المؤقت داخل الذي يمكن التوسط تغليف siRNA في الظروف الفسيولوجية والحث على تأثير "بروتون الأسفنج" لإطلاق سراح siRNA من اندوسوميس في السيتوبلازم على التوالي48 , 49 , 50-في هذه المادة، تعديل في بامام لتعزيز كفاءة الاستقرار والتسليم. ويوفر النظام وبامام-شماعة-R9 رأس ديندريمير بامام الكرة بتهمة إيجابية لتغليف siRNA لمنع التدهور قبل نوكلياسي. ذراع شماعة والببتيد transmembrane R9 كانت تستخدم لتحسين هيدروفيليسيتي لجسيمات نانوية لتحقيق الاستقرار وتعزيز الانتفاع بالخلايا على التوالي.

جودة ونوع من جسيمات نانوية حاسمة بالنسبة لإيصال siRNA فعالة وإسكات الجينات في قلب الزرد. نحن حققت بنجاح ثلاثة جسيمات نانوية هيكلياً متنوعة لهذا الغرض: شماعة-جيش التحرير الشعبي الصيني، وبامام-شماعة-R9، وجزيرة الأمير إدوارد-HYD-إدارات جسيمات نانوية41،،من4243. على الرغم من أنها لا تنتج تجارياً، يمكن بسهولة تجميع وتنقية جسيمات نانوية كما هو موضح سابقا35،،من3743مختبر كيمياء العضوية عادية. هنا، نحن اختيار ديندريمير وبامام-شماعة-R9 كمثال لإظهار التسليم siRNA بسيطة وفعالة، بوساطة dendrimer وإسكات الجينات في قلب الزرد الكبار بعد بتر البطين، لأنه من السهل نسبيا لإعداد تحميل siRNA ديندريمير--مجمعات، مثل التي تفرخ الخليط في درجة حرارة الغرفة ل ~ 20 دقيقة. من ناحية أخرى، ودرجة الحموضة قد يتعين تعديلها لتحميل siRNA نانوكومبليكسيس إذا بي-HYD-إدارات المستخدمة43. وبالمثل، مراهم وتنقية الإجراءات ضرورية للحصول على حل موحد siRNA نانوحبيبات مغلفة إذا كان جيش التحرير الشعبي الصيني-شماعة جسيمات نانوية تستخدم35،41.

هو آخر خطوة حاسمة للتقليل إلى أدنى حد أو لا نزيف أثناء حقن siRNA مغلفة ديندريمير كما هو موضح في 4.5 نظراً للنزيف واسعة يقطع إنعاش القلب وغيرها من النظم البيولوجية. وهكذا، فإننا نقترح باستثناء الأسماك من المجموعات التجريبية إذا كان النزيف يحدث أثناء الحقن. وبصفة عامة، يتقن هذا الإجراء حقن بسيطة بسهولة بعد محاكمات قليلة.

القيود الرئيسية لهذا الأسلوب في التكنولوجيا siRNA في حد ذاتها، مثل الآثار المحتملة خارج الهدف والحذف غير مكتملة للجينات للفائدة. خلاف ذلك، قد تم استنساخه بدرجة عالية من النسخ المتماثل البيولوجية لإسكات الجينات المورثات عدة أظهرت في عملنا، وأن الآخرين41. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول سريعة وبسيطة وفعالة، والعلاج حقن يتغاضى عنها جيدا قبل الزرد الكبار. تحليل تجريبي للكفاءة siRNA إسكات الجينات قد تشمل تقييم مستويات التعبير مرناً بالتهجين في الموقع أو RT-PCR الكمي، أو مستويات التعبير البروتين باستخدام البقع الغربية، المناعي تلطيخ، أو التحليلات الفنية الأخرى. معا، نحن نؤيد تأييدا كاملا siRNA نانوحبيبات تيسير التسليم كأداة بديلة للدراسات الخسارة من الدالة في قلب الزرد الكبار خاصة ويجوز تمديد هذا النهج أيضا على الأجهزة الأخرى في الزرد الكبار والكائنات الأخرى في النموذج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدكتور جيم روس للتعليقات الانتقادية وقراءة المخطوطة. وأيد هذا العمل منح من الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية (31430059، 31701272، 31730061، 81470399، و 31521062)، وآسيا استرا زينيكا، والطب المبتكرة الأسواق الناشئة والتنمية في وقت مبكر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tricaine Sigma E10521 Store at 4 °C
stereomicroscope Leica  S8AP0
sharp forcep WPI 14098
iridectomy scissors WPI 501778
elbow tweezers Suzhou Liuliu SE05Cr
α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) Biomatrik (Jiaxing) Inc. 5239
core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) Andrews ChemServices AuCS-297
vacuum drying equipment Yiheng DZF-6020
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144
tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) Alfar Aesar 51805-45-9 Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.
ultrafiltration tube Millipore UFC900308
freeze dryer Martin Christ Alpha 2-4 Ldplus
NMR spectrometer Bruker AV400
Deuterium oxide(D2O) J&K 174611
NMR sample tube J&K WG-1000-7-50
3 kDa MWCO ultrafiltration tube Merck UFC900308
sea salts Instant Ocean® SS15-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
  2. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
  3. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
  4. Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
  5. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  6. Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1 11889-11895 (2003).
  7. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
  8. Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
  9. Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
  10. Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
  11. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  12. Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
  13. London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
  14. Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
  15. Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
  16. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
  17. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
  18. Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
  19. Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
  20. Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
  21. Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2'-4' conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
  22. Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2',4'-(N-methoxy)aminomethylene and 2',4'-aminooxymethylene and 2'-O,4'-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
  23. Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
  24. Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2',4'-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
  25. Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
  26. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  27. Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
  28. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
  29. de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
  30. Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
  31. McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
  32. Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
  33. Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing's sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
  34. Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
  35. Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
  36. Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
  37. Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
  38. Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
  39. Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
  40. Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
  41. Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
  42. Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
  43. Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
  44. Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
  45. Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
  46. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
  47. Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
  48. Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
  49. Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
  50. Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).

Tags

علم الأحياء التنموي، 137 قضية، الزرد، وتجديد القلب الكبار، جسيمات نانوية، البيولوجيا التنموية، وإسكات الجينات siRNA، وعلم الوراثة
SiRNA نانوحبيبات بوساطة إسكات الجينات في قلب الزرد الكبار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu,… More

Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu, X., Luo, Y., Xiong, J. W. Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (137), e58054, doi:10.3791/58054 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter