Summary
Il reste un défi majeur pour développer conditionnelle gène-knockdown gène-masquage ou efficace dans les organes de poisson-zèbre adulte. Nous rapportons ici un protocole pour exécutante siARN médiée par les nanoparticules gène-baffle en coeur de poisson-zèbre adulte, fournissant ainsi une nouvelle méthode de perte de fonction pour l’étude des organes adultes dans le poisson-zèbre et autres organismes modèles.
Abstract
Les mammifères ont une capacité très limitée pour régénérer le coeur après infarctus du myocarde. En revanche, le poisson-zèbre adult régénère son cœur après résection de l’apex ou cryoinjury, ce qui en fait un organisme modèle important pour l’étude de la régénération cardiaque. Toutefois, le manque de méthodes de perte de fonction d’organes adultes a limité à mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la régénération cardiaque. L’interférence ARN via différents vecteurs est un outil puissant pour faire taire des gènes dans les cellules de mammifères et des organismes modèles. Nous avons déjà rapporté que nanoparticules siARN encapsulé avec succès entrer dans les cellules et entraînent un knockdown de gène-spécifique remarquable au coeur de poisson-zèbre adulte en régénération. Nous présentons ici un protocole simple, rapid et efficace pour la médiation dendrimère ARNsi et gène-baffle en plein coeur de poisson-zèbre adulte en régénération. Cette méthode fournit une autre méthode pour déterminer la fonction des gènes dans les organes adultes chez le poisson zèbre et peut être étendue à d’autres organismes de modèle aussi bien.
Introduction
L’infarctus du myocarde est devenu une menace de santé majeur, conduisant à un énorme fardeau économique autour du monde1. Le cœur des mammifères adult ne parvient pas à se régénérer et reconstituer les cardiomyocytes perdues sur une échelle macroscopique après la blessure, conduisant à la formation de tissus cicatriciels et une insuffisance cardiaque subséquente. Contrairement aux mammifères, le poisson-zèbre est capable de régénération de coeur, principalement par le biais de la prolifération du myocarde robuste après les différents types de lésion cardiaque, ce qui en fait un organisme modèle idéal pour étudier les mécanismes moléculaires de régénération de coeur 2,3,4,5,6,7,8. Décrypter les mécanismes endogènes sous-jacent régénération de coeur de poisson-zèbre est un domaine passionnant de recherche dans la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques améliorer la régénération de coeur humain9.
Il existe des méthodes de manipulation génétique chez le poisson zèbre. Il s’agit de morpholinos (MO) qui sont également largement utilisés dans les grenouilles, Poussin et les mammifères en plus dans le poisson-zèbre10,11,12,13. MO a précipitation efficace d’expression des gènes cible dans la nageoire de poisson-zèbre adulte, le cerveau et la rétine14,15,16,17,18,19. L’acide nucléique verrouillé (LNA) est un autre oligonucléotide artificielle utilisée pour abattre l’expression des gènes endogènes non seulement dans des embryons de poisson-zèbre, mais aussi dans des organes animaux adultes20,21,22, 23 , 24. Cependant, l’absence de méthodes efficaces de perte de fonction pour les coeurs des adultes demeure un obstacle dans l’étude des mécanismes moléculaires de la régénération de l’orgue. À présents, petites molécules inhibiteurs ou expression transgénique de mutants dominants négatifs sont principalement utilisés pour bloquer la fonction d’un gène ou une voie d’étudier sa fonction dans le poisson-zèbre adulte coeur régénération25,26 ,,27. Cependant, tous les gènes ou les voies de signalisation sont applicables pour ces méthodes.
Petit-interférant RNAs (siARN) sont largement utilisés pour l’analyse de la perte de fonction dans les cellules de mammifères et d’embryons des organismes modèles, ainsi que des organes adultes pour des études précliniques chez animal modèles28,29,30 , 31 , 32. siARN ont été utilisés efficacement pour réduire au silence des gènes dans les tumeurs33,34,35 et dans les cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 par l’intermédiaire de différents vecteurs. Récemment, nous avons développé efficace encapsulé siARN NANOPARTICULE-silençage génique en plein adulte régénérant à l’aide de plusieurs différentes nanoparticules41,42,43, fournissant un nouvel outil pour études fonctionnelles des gènes dans les organes de poisson-zèbre adulte. D’après nos précédentes études41,42,43, nous présentons un protocole simple, pratique et puissant pour les siARN gène-baffle en plein coeur de poisson-zèbre adulte régénérant à l’aide de f-PAMAM-PEG-R9 dendrimères. Aldh1a2 (aldéhyde déshydrogénase 1, membre de la famille A2) gène a augmenté après résection d’apex de poisson-zèbre et ablation des Aldh1a2 bloqué la régénération cardiaque44. Ici nous prenons aldh1a2 gène par exemple pour tester l’efficacité défiant gène médiée par injection de siARN nanoparticules encapsulées. Ce protocole prévoit une procédure pour résection de coeur de poisson-zèbre, la synthèse chimique des nanoparticules et une méthode de livraison sur les nanoparticules de siARN encapsulé dans le coeur de poisson-zèbre adulte.
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Protocol
Toutes les procédures animales utilisé un protocole de poisson-zèbre approuvé par le Comité de l’urbanisme à l’Université de Pékin, qui est entièrement accrédité par Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care et d’institutionnels animalier.
1. préparation de la Solution de tricaïne
- Pour préparer la solution mère de tricaïne, ajouter 400 mg éthyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate de poudre à 97,9 mL d’eau distillée et ajouter ensuite 2,1 mL de 1 M Tris (pH 9,5) pour ajuster le pH à 7 ~. Stocker la solution-mère à 4 ° C.
- Pour préparer la solution de travail de tricaïne, ajouter solution mère de tricaïne 4,2 mL à 100 mL d’eau système aquarium.
2. adult poisson zèbre résection ventriculaire
- Préparer les instruments et les matériaux pour la chirurgie incluent un morceau d’éponge, une boîte de Pétri remplie de tricaïne travail solution, une pipette en plastique, un stéréomicroscope, pinces à deux tranchants, ciseaux iridectomie, et coude pincettes (Figure 1).
- Préparer une petite rainure de la taille de 4 x 0,5 cm et 0,5 cm de profondeur sur une éponge pour tenir le poisson-zèbre pendant la chirurgie d’exérèse ventriculaire.
- Remplissage d’un réservoir de poisson-zèbre 3 L avec la moitié d’un réservoir d’eau de système de poisson-zèbre qui est effectuée à l’aide de mer de 60 mg/L de sels en dH2O pour la récupération du poisson blessé.
- Anesthésier les poissons dans une boîte de Pétri avec solution de tricaïne de 10 cm jusqu'à ce que les mouvements de gill diminuent à une par seconde et garder le poisson au moins 30 s pour s’assurer qu’il est complètement anesthésié.
- Transférer les poissons anesthésiés avec la pince de coude à la gorge dans une face ventrale d’une éponge humide vers le haut. Localiser visuellement la marge du cœur battant et puis recherchez le cœur sous un stéréomicroscope.
- Utiliser les ciseaux iridectomie pour faire une petite incision d’environ 1 mm qui pénètre la peau et les muscles et soigneusement déchirer la couche épithéliale argentée du sac péricardique avec les conseils de pinces pour accéder au cœur. Ne pas insérer la pince trop profondément dans la cavité afin d’éviter les blessures de cœur.
Remarque : À ce stade, n’oubliez pas d’éviter des saignements. Exclure les poissons de l’expérience en cas de saignement étendu, puisque les saignements excessifs sont principalement causée par la blessure accidentelle au cœur et entraîneront donc trompeuse des résultats. - Exposer le ventricule en appuyant doucement son apogée avec une forte pince à l’aide de la main non dominante ou en appliquant une pression abdominale modérée. Puis, avec l’autre main, enlever environ 20 % du ventricule au sommet en utilisant les ciseaux iridectomie.
Remarque : Aucun saignement étendu ne devrait se produire à ce stade. - Utiliser une serviette humide pour couvrir l’incision, comme la purge de plaies abondamment pour 15 – 45 s avant coagulation et puis remettre le poisson dans le réservoir d’eau du système.
Remarque : Il n’est pas nécessaire de suturer l’incision. - Assurez-vous que le poisson retrouve gill mouvements moins de 1 min et puis recommence natation. Si le poisson ne montre pas les mouvements de gill après 50 s dans l’eau, il faciliter en injectant l’eau dans les branchies à l’aide d’une pipette en plastique jusqu'à ce que le poisson reprend une ventilation active.
- Maintenir le poisson dans le système de recyclage après la résection ventriculaire.
Remarque : Aucun soucis spéciaux ne sont nécessaires contre les poissons normaux. Le taux de mortalité du poisson-zèbre adulte résection ventriculaire est environ de 5 à 10 %. Presque tous les décès se produit dans les 24h après la chirurgie.
3. préparation de nanoparticules de siARN encapsulé
- Synthétiser le f-PAM4-PEG-R9 dendrimère.
NOTE : La synthèse de f-PAM4-PEG-R9 dendrimère matériaux a été réalisée comme décrit précédemment37 avec quelques modifications. La longueur de α, ω-dipyridyle disulfido polyéthylène glycol (PEG-Py-Py) ont été réduites à un poids moléculaire de 1000 pour maximiser l’encapsulation des siRNAs (Figure 2B). - 10 mg du noyau cystamine de G4.0 polyamidoamine (appelé PAMAM) à l’aide de séchoir sous vide à 45 ° C pendant 1 h à sec et ensuite dissoudre la PAMAM dans tampon phosphate salin de 2 mL Dulbecco (SPD, une solution saline équilibrée utilisée pour une variété d’applications de culture de cellules).
- Dissoudre la phosphine tris(2-carboxyethyl) de 1,7 mg (TCEP) dans 1 mL SPD, mélanger avec la solution PAMAM préparée en 3.2 et laisser à température ambiante en agitant doucement pendant 8 h.
NOTE : PTCE est décuplé en excès pour les ponts disulfures de la PAMAM molaire. - Supprimer le PTCE excessif par ultrafiltration. Ajouter SPD au mélange PAMAM-PTCE ci-dessus pour atteindre le volume de 10 mL et la solution est transférée dans un tube d’ultrafiltration 3 kDa MWCO (poids moléculaire coupée). Après la centrifugation à 3 000 g pendant 15 min, jeter la solution dans le tube de prélèvement. Ajouter SPD pour le dispositif de filtration jusqu'à 10 mL et doucement pipette l’échantillon plusieurs fois et centrifuger à nouveau. Répétez cette étape pour 4 fois. Après la dernière filtration, aspirer l’échantillon provenant du dispositif de filtration.
Remarque : Le produit de cette étape est réduit PAMAM (appelé f-PAM4). - Dissoudre 14 mg PEG-Py-Py dans 1 mL SPD, mélange avec la solution f-PAM4 et laissez-le en agitant doucement à température ambiante pendant 3 h. Puis retirez la Py-PEG-Py excessive par l’étape d’ultrafiltration tel que décrit dans la version 3.4. Après la dernière filtration, aspirer l’échantillon provenant du dispositif de filtration.
Remarque : Le produit est appelé comme f-PAM4-PEG-Py. Le montant de PEG-Py-Py est 10 fois dans un rapport molaire aux groupes thiol dans le f-PAM4. - Dissoudre 6,4 mg de cystéine résilié R9 Peptide (Ac-CRRRRRRRRR-NH2) dans 1 mL SPD, mélanger avec f-PAM4-PEG-Py et remuer doucement pendant 8 h à température ambiante. Purifier le produit final, appelé f-PAM4-PEG-R9, par l’étape d’ultrafiltration tel que décrit dans la version 3.4 sauf que SPD est remplacée par l’eau désionisée. Lyophiliser le produit en utilisant un gel vide sèche.
Remarque : Les produits en 3.5 et 3.6 avant lyophilisation sont conservés à-20 ℃ pendant au moins 1 mois. Après la lyophilisation de f-PAM4-PEG-R9, les échantillons sont conservés à-20 ℃ pendant au moins 2 mois. - Pour déterminer le degré de modification PEG et peptide, dissoudre 5 mg de la f-PAM4-PEG-Py en D2O (oxyde de deutérium) et transférez-le dans le tube d’échantillon de RMN (résonance magnétique nucléaire). Effectuer une analyse spectrale RMN 1H à 400 MHz et analyser les données à l’aide de NMR données analyse logiciel37.
Remarque : En particulier, le représentant PAMAM pics (- NCH2CH2CO-), PEG pics (- OCH2CH2-) et pics de résidus arginine (- HCCH2CH2CH2NH-) dans les peptides sont censés être dans les gammes 2.4 à 2.6, 3,7 à 3,8 et 1,6 à 1,8 ppm, respectivement. Déterminer le degré de modification de la PEG et R9 par rapport à la PAMAM en calculant les intégrales des pics pics PAMAM PEG et R9. Le degré de modification de PEG est 100 % et la modification de la R9 est au moins 50 %. Les analyses spectrales 1H-RMN sont réalisées dans le laboratoire central de l’institution. - Dissoudre le f-PAM4-PEG-R9 dendrimère poudre dans du PBS à 4 mg/mL et faire des parties aliquotes de la solution pour un usage unique.
Remarque : La solution dendrimère peut être conservée à-20 ° C pendant au moins un mois, sans répétés de gel et de dégel. - Dissoudre la cyanine marqué colorants siRNAs (appelés Cy5-siARN), les siARN Aldh1a2 ou les siARN contrôle négatif brouillée dans l’eau distillée à 10 µM.
Remarque : Utilisez la cyanine marqué colorants siRNAs pour évaluer si le siARN nanoparticules encapsulées peut entrer au cœur de poissons (Figure 2A-B). Ce protocole prend aldh1a2 comme un gène exemple pour déterminer l’efficacité de la livraison de f-PAM4-PEG-R9 dendrimère-encapsulés siRNA. Les séquences de la siARN sont : Cy5-siARN brin antisens : 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′, siAldh1a2 brin anti-sens : 5'-UUCAGGACAACCGUGUUCCdTdT-3' et brin antisens de siARN contrôle négatif brouillés : 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'. - Pour préparer la solution de nanoparticules encapsulées siRNA, mixer siARN avec un volume égal de solution dendrimère et incuber l’échantillon à la température ambiante pendant 20 min. préparer fraîchement la solution de siARN-NANOPARTICULE avant utilisation.
Remarque : Le volume de solution de nanoparticules encapsulées siARN dépend du nombre de poissons va être injecté. Par exemple, préparer au moins 120 µL de solution de dendrimer (mix 60 µL de solution de siRNA et 60 µL de solution de dendrimer) pour l’injection de 10 poissons (~ 10 µL par poisson), la perte de la solution de comptage.
4. injection de nanoparticules siARN encapsulé dans cœur de poisson-zèbre adulte
- Comme décrit ci-dessus, préparer un morceau d’éponge avec un groove, une boîte de Pétri 10 cm rempli de solution de tricaïne, une pipette en plastique, un stéréomicroscope, pincettes de coude et une seringue à insuline (Figure 1), ainsi que d’un réservoir de poissons avec système d’eau pour le logement des les poissons après l’injection.
- Laisser le poisson-zèbre blessé préparé en étapes 2.1 – 2.10 pour récupérer pour 1 jour après la résection ventriculaire et puis anesthésier les poissons (amputation après jours) dpa 1 solution de tricaïne comme décrit au point 2.4.
- Transférer les poissons anesthésiés, face ventrale vers le haut, à la rainure de l’éponge humide à l’aide de la pincette de coude. Localiser le coeur battant sous le stéréomicroscope.
- Charger 10 µL de la solution de nanoparticules siARN encapsulé dans la seringue à insuline. Éviter autant que possible de bulles.
- Immobiliser le poisson délicatement à l’aide de la pince à épiler coude à retenir la région thoracique avec la main non dominante. Ne pas serrer trop fermement le poisson.
Remarque : N’oubliez pas qu’aucun saignement étendu ne devrait se produire pendant l’injection. - Tenir la seringue remplie d’insuline à ~ 30° et injecter 10 µL de solution dans la cavité thoracique à l’aide de l’autre main (la Figure 1).
Remarque : La solution s’écoule parfois pendant l’injection, mais cela n’affecte pas l’effet du siRNA. La solution de siARN-NANOPARTICULE peut être injectée une fois par jour pendant plusieurs jours à un mois, selon un plan expérimental spécifique. Injecter un poisson avec un seul type de siARN chaque fois. Si plus de deux types de siARN doivent être injectés dans un poisson, injecter un seul type de siARN chaque fois et ensuite injecter un autre type de siARN 1 h plus tard. Dans le présent protocole, qu’un seul type de siARN par poisson a été injecté. - Transférer les poissons dans le réservoir avec de l’eau du système.
Remarque : Les poissons devraient redémarrer ventilation moins de 1 min et puis reprendre la natation. L’injection de nanoparticules encapsulées siARN ou siRNA normalement n’entraîne pas la mort chez le poisson zèbre adulte.
5. coeur de Collection, Fixation et l’évaluation de l’efficacité des siARN livraison
- Préparer 1 mL de solution dans un tube de microcentrifuge paraformaldéhyde à 4 % pour chaque groupe.
- Anesthésier les poissons de tricaïne solution à certains jours après les injections. Placer le poisson passivement dans la rainure dans une éponge humide. Faire une grande incision dans la région thoracique et ouvrir largement avec la pince à épiler. Tenez le tube de sortie et tirez le cœur tout doucement avec la pince à épiler.
- Rincez le coeur avec du PBS et rapidement évacuer le liquide supplémentaire avec une serviette. Mettre jusqu'à 10 cœurs dans un tube de microtubes de 1,5 mL avec 1 mL de paraformaldéhyde. Inverser le tube plusieurs fois doucement et garder durant la nuit à 4 ° C.
- Mesurer l’intensité de la fluorescence des coeurs Cy5-siARN-injecté à l’aide de l' in vivo imaging system (la Figure 2). Utiliser 3 à 4 coeurs de poisson zèbre pour chaque groupe dans cette étude.
- Monter les coeurs fixes avec paraffine ou OCT composé (enrobage moyen pour les échantillons de tissus congelés assurer une température optimale de coupe).
6. evaluation des siARN NANOPARTICULE-mediated Gene silencing
- Préparer un récipient isolé et longue pince à épiler. Verser dans l’azote liquide à un tiers du volume du conteneur.
- Anesthésier les poissons en solution de tricaïne à dpa 2. Disséquer les coeurs comme décrit au point 5.2 et puis supprimez la sortie et l’atrium.
NOTE : Le poisson peut récupérer de la chirurgie en une seule journée et ensuite injecté à 1 dpa avec les nanoparticules soit brouillées siARN encapsulé (siNC) comme un négatif contrôle ou aldh1a2 encapsulé siARN nanoparticules (siAldh1a2). - Transférer les ventricules dans un tube de microtubes de 1,5 mL à l’aide de la pince à épiler, couvrir le couvercle du tube et placer immédiatement le tube dans le récipient isolé avec de l’azote liquide. Laissez le flotteur de tubes sur l’azote liquide pour quelques min. utilisation la longue pince à épiler pour retirer les tubes du conteneur.
- Répétez les étapes 6.2 et 6.3 jusqu'à ce que tous les ventricules sont collectées. Utiliser 6 – 10 coeurs pour chaque groupe.
- Extraire l’ARN total des coeurs avec le réactif d’isolement d’ARN. Évaluer les niveaux d’expression des gènes respectifs par RT-PCR quantitative en utilisant des amorces Gapdh F: GATACACGGAGCACCAGGTT ; GAPDH r : GCCATCAGGTCACATACACG ; Aldh1a2 F: TGAGCGAGGAGCAGCAGAGA ; Aldh1a2 r : TCCACGAAGAAGCCTTTAGTAGCA.
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Representative Results
Pour déterminer l’efficacité de la médiation dendrimère ARNsi, nous réséqué l’apex du ventricule du coeur zebrafish, puis injecté environ 10 µL de dendrimer seulement (groupe fictif), Cy5-siARN seulement (groupe nu) ou f-PAMAM-PEG-R9 dendrimère-encapsulés Intrapleurale Cy5-siARN (groupe Cy5-siARN), respectivement (Figure 2A-B). Le signal de fluorescence a été détecté dans les coeurs injectés avec dendrimère-encapsulés Cy5-siARN à 3, 24 et 48 hpi (heures après l’injection), alors qu’il était difficilement décelable dans les coeurs des groupes simulacres et nus à 48 hpi (Figure 2C-D), ce qui laisse supposer que le f-PAMAM-PEG-R9 dendrimère efficacement facilite la livraison des siRNAs dans le cœur de poisson-zèbre adulte et est stable pendant au moins deux jours.
Pour étudier l’effet des siARN dendrimère-encapsulés sur silençage génique, nous avons choisi aldh1a2 (enzyme de synthèse de l’acide rétinoïque) comme un gène cible, qui a été signalé à être exigée pour la régénération du coeur après résection ventriculaire44 . Comme illustré à la Figure 3A, les poissons étaient resurgir pendant une journée après résection ventriculaire et puis micro avec siARN dendrimère-encapsulés. Nous avons constaté que le niveau d’expression de mRNA aldh1a2 diminué dans les coeurs traités avec f-PAMAM-PEG-R9 dendrimère-encapsulés siAldh1a2 comparée à celle des siARN brouillé dendrimère-encapsulés (siNC) à 2 dpa (Figure 3B), ce qui démontre que f-PAMAM-PEG-R9 dendrimère-mediated siRNAs atteindre gène-spécifique faisant taire en coeur de poisson-zèbre adulte.
Figure 1 : Chirurgie cardiaque et instruments d’injection thoracique. Photographie des instruments utilisés pour la résection ventriculaire dans le coeur de poisson-zèbre adulte : éponge avec une rainure, coude pincettes, pinces tranchants, ciseaux iridectomie, longue pince à épiler et la seringue d’insuline utilisée pour ARNsi dendrimère-encapsulés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : F-PAMAM-PEG-R9 dendrimère-assisted prestation efficace des siARN dans le cœur de poisson-zèbre adulte blessé. Schéma (A) pour étudier l’efficacité d’absorption des nanoparticules encapsulées Cy5-siARN dans cœur de poisson-zèbre adulte après résection ventriculaire (dpa : amputation après jours ; hpi : heures après l’injection). (B) synthèse de f-PAMAM-PEG-R9 dendrimère et préparation de dendrimer-encapsulés Cy5-siARN. (C) imagerie de fluorescence Cy5 des cœurs injecté avec seulement les dendrimères (mock), Cy5-siARN seulement sans dendrimère encapsulation (nue) et encapsulées dendrimère fluorescence étiquetés Cy5-siARN (Cy5-siARN) détectée par l’imagerie in vivo système, montrant que les signaux de fluorescence sont presque indétectables dans les groupes de simulacres et nus à 48 hpi, tandis que les signaux forts conservés dans les groupes de Cy5-siARN dendrimère-encapsulé de 3 à 48 hpi. L’échelle arbitraire des signaux de fluorescence montre de faibles (bleu) à forte (rouge). (D) Quantification de la fluorescence Cy5-siARN les signaux dans le coeurs évalués par l' in vivo d’imagerie comme panneau C (* P < 0,05, *** P < 0,001 ; données sont moyenne ± s.e.m. ; analyse de variance suivie de Bonferroni de comparaison multiple tests ; n = 3-4 coeurs). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Faire taire les siARN efficace aldh1a2 dans le coeur de poisson-zèbre adulte blessé. Schéma (A) pour étudier les effets de gène-baffle de siARN aldh1a2 . (B) qPCR révèle aldh1a2 ARNm a diminué dans les coeurs de nanoparticules encapsulées siAldh1a2 par rapport aux coeurs de siARN brouillés nanoparticules encapsulées (siNC). Le niveau aldh1a2 d’expression des ARNm a été normalisé par GAPDH (*** P < 0,001 ; données sont des moyennes ± s.e.m. avec jumelé test t de Student). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : Images de l’injection de la cavité thoracique. (A), la cavité thoracique chez les poissons adultes à 1 jours après amputation. (B) Injection de siARN NANOPARTICULE encapsulé dans la cavité thoracique. Barreaux de l’échelle : 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 2 : efficacité de l’absorption de nanoparticules encapsulées Cy5-siARN cœur blessé de poisson-zèbre adulte. (A) imagerie de fluorescence Cy5 des cœurs injecté avec dendrimères seulement (mock), nu Cy5-siARN sans dendrimère encapsulation (nue) et encapsulées dendrimère Cy5-siARN sous l' in vivo système d’imagerie. L’échelle arbitraire des signaux de fluorescence est de faible (bleu) à forte (rouge). (B) Quantification de la fluorescence Cy5-siARN signale dans les coeurs, mesurée par l' in vivo d’imagerie système, comme celui du groupe A (NC : non significatif différent ; données sont moyenne ± s.e.m. ; analyse de variance suivie le Bonferroni de multiples test de comparaison ; n = 3-4 coeurs). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le poisson-zèbre est tout à fait capable de régénérer des divers organes dont le coeur adulte5. Tandis que les méthodes transgéniques et génétiques sont bien développés pour l’étude des fonctions des gènes chez les embryons de poisson-zèbre, enquêteurs sont toujours confrontés à la lourde tâche de générer des allèles mutants conditionnels dans le poisson-zèbre45,46. Ainsi, des mutants transgéniques dominant négatif ou inhibiteurs de petites molécules servent souvent à fonctions des gènes adresse en poisson zèbre adulte organes25,27,,42. Au cours des dernières années, nous avons développé une méthode alternative pour l’analyse de la perte de la fonction des gènes dans le coeur de poisson zèbre adulte à l’aide d’ARNsi médiée par les nanoparticules et gene silencing41,42, 43. ici, un protocole détaillé pour cette méthode à l’aide de siARN dendrimère-mediated silençage génique dans les coeurs de poisson-zèbre en particulier et, éventuellement, dans d’autres organes de poisson-zèbre, en général, est présenté.
La molécule de siARN ne peut entrer dans les cellules par lui-même en raison de sa charge négative et pourrait être facilement dégradée par la nucléase. Avec mono-disperser les molécules, les propriétés et les structures accordables, dendrimères ont été considérées comme prometteur siARN transporteurs 47. Les dendrimères PAMAM ont riches périphéries cationiques et amines mise en mémoire tampon à l’intérieur duquel pourraient médiation siARN encapsulation dans des conditions physiologiques et d’induire un effet « éponge de proton » pour libérer les siARN des endosomes dans le cytoplasme respectivement48 , 49 , 50. dans cet article, la PAMAM a été modifiée pour améliorer l’efficacité de stabilité et de la livraison. Le système de f-PAMAM-PEG-R9 offre une tête de dendrimer PAMAM hémisphérique avec la charge positive pour l’encapsulation de siARN empêcher la dégradation par les nucléases. Le bras de la cheville et le peptide transmembranaire R9 a été utilisé pour améliorer la hydrophilicité des nanoparticules pour la stabilisation et favoriser l’absorption par les cellules respectivement.
La qualité et le type des nanoparticules sont cruciales pour la livraison de siARN efficace et gène-baffle en plein coeur de poisson-zèbre. Nous avons étudié avec succès trois nanoparticules structurellement-divers à cet effet : PEG-PLA, nanoparticules f-PAMAM-PEG-R9 et PEI-HYD-RGD41,42,43. Bien qu’ils ne sont pas fabriqués industriellement, un laboratoire régulières chimie organique peut facilement synthétiser et purifier les nanoparticules comme décrit plus haut35,37,43. Ici, nous avons choisi le f-PAMAM-PEG-R9 dendrimère comme un exemple pour montrer le simple, efficace, dendrimère-mediated ARNsi et gène-baffle en plein coeur de poisson-zèbre adulte après résection ventriculaire, parce qu’il est relativement facile à préparer des siARN chargés dendrimère-complexes, tels qu’en incubant le mélange à température ambiante pendant environ 20 min. En revanche, le pH doit être ajusté pour nanocomplexes siARN chargés si PEI-HYD-RGD est utilisé43. De même, les procédures émulsifiants et la purification sont essentielles pour obtenir solution uniforme encapsulé NANOPARTICULE siARN si PEG-PLA nanoparticules sont utilisés35,41.
Une autre étape cruciale consiste à réduire au minimum ou n’avoir aucun saignement pendant l’injection de siARN dendrimère-encapsulé comme décrit dans 4.5 car saignement étendu interrompt la régénération cardiaque et autres systèmes biologiques. Ainsi, nous suggérons à l’exclusion des poissons de groupes expérimentaux si le saignement se produit pendant l’injection. En règle générale, cette procédure d’injection simple est facilement maîtrisée après quelques essais.
Les principales limites de cette méthode sont dans la technologie de siARN elle-même, tels que les effets potentiels hors cible et incomplète délétion de gènes d’intérêt. Dans le cas contraire, la réplication biologique hautement reproductible de gène-baffle de plusieurs gènes a été démontrée dans notre travail et celui des autres41. Ce qui est important, ce protocole est rapide, simple et efficace, et le traitement par injection est bien toléré par le poisson-zèbre adulte. Analyse expérimentale de siARN silençage génique efficacité peut-être inclure l’évaluation des niveaux d’expression ARNm par hybridation in situ ou RT-PCR quantitative, ou des niveaux d’expression de protéine à l’aide des Western blots, immunohistochemical souillant, ou autres analyses fonctionnelles. Ensemble, nous soutenons pleinement ARNsi facilitées par nanoparticules comme un outil alternatif pour les études de la perte de fonction dans le coeur de poisson-zèbre adulte en particulier, et cette démarche peut également être étendue à d’autres organes dans le poisson-zèbre adulte et autres organismes modèles.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Dr IC Bruce d’observations critiques et la lecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 et 31521062), en Asie de AstraZeneca et émergents marché médecine innovatrice et développement précoce.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4 °C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
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