Summary
Denne protokollen beskriver en metode for storskala dyrking av Caenorhabditis elegans på solid medier. Som et alternativ til flytende kultur kan denne protokollen få parametere av forskjellige skalaer under plate-baserte dyrking. Dette øker sammenlignbarheten resultater ved å utelate morfologiske og metabolske forskjellene mellom flytende og fast mediekultur.
Abstract
Dyrking Caenorhabditis elegans (C. elegans) i en stor måte på agar plater kan være tidkrevende og vanskelig. Denne protokollen beskriver en enkel og rimelig metode for å få et stort antall dyr for isolering av proteiner fortsette med en western blot, massespektrometri eller ytterligere Proteomikk analyser. Videre, en økning på Rundormer tall for immunostainings og integrering av flere analyser culturing oppstiller kan lett oppnås. I tillegg er en overføring mellom plater med forskjellige eksperimentelle forhold tilrettelagt. Vanlige teknikker i plate kultur innebærer overføring av en enkelt C. elegans bruke en platina ledning og overføring av befolkede agar biter ved hjelp av en skalpell. Men med økende Rundormer tall, bli disse teknikkene altfor tidkrevende. Denne protokollen beskriver store kultur C. elegans inkludert mange skritt å minimere virkningen av prøven forberedelsen på fysiologi av ormen. Væske og skjæring stress kan forandre levetid og metabolske prosesser i C. elegans, noe som krever en detaljert beskrivelse av de avgjørende skritt for å hente pålitelig og reproduserbar. C. elegans er en modell organisme, bestående av neuronal celler for opptil en tredjedel, men mangler blodkar, noe som gir muligheten til å undersøke utelukkende nevronale endringer uavhengig av vaskulær kontroll. Nylig fant tidlig neurodegeneration i diabetisk retinopati før vaskulær endringer. Dermed er C. elegans av spesiell interesse for å studere generell mekanismer for diabetiker komplikasjoner. For eksempel en økt dannelse av avanserte glycation end produkter (alder) og reaktive oksygen arter (ROS) er observert, som reproduserbar finnes i C. elegans. Protokoller for å håndtere prøver av tilstrekkelig størrelse for et bredere spekter av undersøkelser presenteres her, eksemplifisert ved studier av diabetes-indusert biokjemiske endringer. Generelt denne protokollen kan være nyttig for studier som krever store C. elegans tall og som flytende kultur er ikke egnet.
Introduction
Protein analyser, for eksempel western blot eller massespektrometri, krever milligram protein. Dette gir krever en storskala dyrking av hundrevis av C. elegans, som kan oppnås ved flytende kultur eller på solid media overføre nematoder ved vask. Væske og skjæring stress induserer uttrykk for epithelial natrium kanaler (ENaC), som kan øke osmotisk stress gjennom en økt opptak av natrium, potensielt endre levetiden C. elegans og påvirke metabolske analyser1 . Derfor ta noen viktige skritt i denne protokollen for plate-basert tilnærming reduksjonen av stress påvirker eksperimentell variasjoner hensyn. Flytende kultur, derimot, påvirker fenotypen av nematoder og kompliserer kulturen og samling av et nøyaktig antall nematoder2. Videre reaktive stoffer kan endres ved media komponentene og kan distribuere ujevnt før nematoder. Om begrensningene for flytende kultur gir denne protokollen en alternativ tilnærming til dyrking store prøver C.elegans.
C. elegans er en modell organisme med et tydelig nettverk av 302 neuronal celler, utgjør en tredjedel av alle sine celler3. Siden introduksjonen i vitenskap, mange homologe og orthologous gener er beskrevet, forsterke sin verdi som en modell for medisinsk forskning. Nylig presentert bevis for nevrologiske svekkelse i diabetisk retinopati, foregående vaskulære skader,4. C. elegans mangler blodkar, men inneholder et distinkt nevrale nettverk, gjør det en passende modell å undersøke nevronale endringer fra vaskulær seg. Dermed er C. elegans av spesiell interesse for å studere generell mekanismer for diabetiker komplikasjoner. Biokjemiske endringer i diabetiker komplikasjoner innebære dannelsen av aldre, som ytterligere påvirker dannelsen av ROS svar hyperglykemi5. Finnes i C. elegans og bidra til neuronal skade6. Kroniske sykdommer er ofte forårsaket av komplekse, polygenic prosesser som krever en multiparametric tilnærming for å vurdere deres underliggende mekanismer, som eksemplifisert her med vurdering av diabetiker komplikasjoner. Denne protokollen kan være til nytte for å få flere parametere samtidig, og senere. Økt sammenlignbarhet og reproduserbarhet multiparametric tilnærming kan oppnås ved å utelate morfologiske og metabolske forskjellene mellom flytende og fast mediekultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Denne protokollen er inndelt i fem seksjoner. I delene 1 – 3: den viktigste protokollen til kultur C. elegans på en storstilt presenteres. Avsnitt 4 og 5 gir ytterligere protokoller for vurdering av eksemplifisert metabolitter forekommer i diabetiker metabolitter. I detalj beskriver Seksjon 1 en generell store kultur på platene. Del 2 fokuserer på overføring av store mengder C. elegans, mens del 3 forklarer høsting av et omfattende utvalg. Del 4 forklarer protein isolasjon fra utvalget og seksjon 5 beskriver eksempel forberedelse for påfølgende flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) analyser.
1. omfattende kultur på plater
- Vanligvis arbeid under sterilt hette eller ved siden av åpen flamme å unngå forurensing.
-
Kultur ormer før de når unge voksne scenen, Følg denne tidligere publiserte protokollen7 med de følgende tilpasninger.
- Bruke levende Escherichia coli OP50 bakterier å mate nematoder og forberede 400 µM fluorodeoxyuridine agar (ikke ampicillin/FUdR) eksperimenter.
- For utarbeidelse av en synkron befolkning, bruke unconcentrated OP50, og for etterfølgende eksperimenter med voksne, bruke 3.3 x konsentrert OP50 ved å fjerne 70% av nedbryting.
- Daglig fôring intervaller anbefales. Når vurdere oksidativt stress, ulike intervaller og volumer for fôring kan påvirke resultatene.
- For inoculation, ta en plate med flere nematoder og skjær den i stykker av ca 0,5 x 1 cm2 med skalpell. Overføre to til tre stykker på Rundormer vekst medier (NGM) plater av 60 mm i diameter, med unconcentrated OP50.
- Inkuber platene på temperaturen egnet for belastningen (vill-type N2 bør kultivert på 20 ° C) til egg er synlige på tallerkenen.
- Vask av de fleste av egg og voksen dyr med 2 mL M9 buffer og samle dem i en 15 mL tube. Sentrifuge suspensjon 800 x g i 2 minutter. I mellomtiden, begynne å forberede bleking løsningen.
- Ta ut centrifuged røret og fjerne M9 buffer med en 10 mL pipetter. Legg til 10 mL av bleking løsningen og blanding virvelen til de voksne nematoder er lysed. Dette tar vanligvis ca 5-7 min, men bør ikke ta mer enn 15 min eller egg vil ikke utvikle fullt senere på i eksperimentet.
- Sentrifuge suspensjon 800 x g i 2 min. vask 3 ganger med 10 mL M9 buffer fjerne egg fra blekemidler løsning.
- Nå legge 150 µL av egg suspensjon på OP50 plater. En tetthet av 200-300 egg skal nås på hver plate. Vent til nematoder nådd det voksne stadiet.
Merk: M9 bufferen (pH 7.0) brukes for avbildet eksperimenter består av følgende substanser: 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4og 86 mM NaCl. Etter autoklavering blandingen, Legg 1 mM MgSO4. Bleking løsningen inneholder 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl løst i destillert vann. - Forberede sterilt M9 buffer, sterile pipette-spisser med et kutt tips å vaske av ormer, og 15 mL rør å samle dem i.
- Bruke ca 1 mL av M9 buffer på platene, forsiktig distribuere bufferen ved svingende og forsiktig Pipetter nematoder av platen.
- Nå samle nematoder i røret. Bruke 150 µL av suspensjon direkte på platene (seeding med OP50) med kutt pipette-spisser og evaluere mikroskopisk tettheten av nematoder (anbefalt: 50-100 nematoder per 60 mm plate).
- Hvis de er for tette, fortynne suspensjon med M9 buffer og vurdere det under mikroskopet til den ønskede tettheten er nådd. Hvis avkastningen er for lite, la ormer conditions eller sentrifuge suspensjon 10 s 800 x g fjerne væske.
Merk: Et eksempel på en tettheten er gitt i figur 1A (makroskopisk) og 1B (mikroskopisk) på 20 X augmentation. Fortsette empirisk som beskrevet. - Huske på at ormer bosette seg raskt. For å sikre en lik fordeling mellom platene, invertere røret etter hver bunke plater (4-5 plater).
Merk: Kuttet Pipetter tips, samt milde svingende og vask av platene, reduserer skjæring stress.
2. overføring av store mengder av Caenorhabditis elegans
- Vask av nematoder med ca 500 µL av M9 buffer, avhengig av alder og tørrhet i platene. Bruker samme bufferen, gjenta koble nematoder til de fleste av dyrene er samlet i suspensjon.
- Sakte tar opp nematoder med kutt pipette tips og overføre dem på en plate med OP50. La platen tørr.
Merk: Vær forsiktig med å bruke mye mer enn anbefalt. Spesielt i langsiktig eksperimenter, platene kan ikke tolerere det og agar kan bryte, slik at nematoder å krype inn i sprekker.
3. innhøstingen av en stor Caenorhabditis elegans Sample
- Avhengig av den valgte metoden, starter du eksperimenter med en tilstrekkelig mengde C. elegans. For LC--MS-/ MS analyser, forberede 20 plater (60 x 15 mm) per gruppe med omtrent 100 nematoder per plate å sikre en avkastning på minst 200 µg protein per eksempel.
Merk: Denne delen av protokollen krever ikke fungerer under sterile forhold lenger, som nematoder samles og frosset. - På dagen for eksempel samlingen, forberede flytende nitrogen til snapin-fryse i de innsamlede eksemplene. Hold ikke-sterilt M9 buffer på is å avta det Rundormer metabolisme.
- Vask av C. elegans fra platene bruk 1 mL av M9 buffer og forsiktig virvlende platene. Dette unngår å samle avdøde nematoder og de fleste egg, hvis det er alle tilstede, fordi de holde seg til bakterier og agar.
- Ta opp volumet og overføre den til en 15 mL tube.
- Etter samlingen komplett prøven, vent nematoder å avgjøre eller sentrifuge røret kort på 800 x g og fjerne det meste av M9 bufferen. Vask prøven 3 x med ca 10 mL av M9 (10 x prøve volumet) å fjerne eventuelle bakterier.
Merk: For å sikre at alle avdøde nematoder fjernes, sukrose floatation er et annet alternativ. Dette var imidlertid ikke egnet for de viste eksperimenter15. Sukrose er hydrolyzed glukose og fruktose. De avbildede eksperimenter, ble rollen av glukose vurdert for å fremme biokjemiske endringer i kronisk diabetes. Dermed kan sukrose floatation potensielt forvirre resultatene. - Forbered en 1,5 mL tube med 1 mL av M9 buffer og en tom 1,5 mL tube for hvert utvalg. Overføre pellets med et glass Pipetter fra 15 mL tube til tom 1,5 mL røret. Dette trinnet er avgjørende for å sikre en kvantitativ overføring.
Merk: I motsetning til i forrige trinn, her nematoder er mer konsentrert. På grunn av en mulig tilslutning til plast Pipetter tips, er tap av en stor del av prøven forventet. Derfor bruk glass Pipetter i stedet. - Etter overføringen, bruke glass pipette for å ta opp 1 mL av M9 buffer fra den andre 1,5 mL tuben skylle nematoder fra pipette veggen. Også vask de gjenværende nematoder fra 15 mL røret og overføre dem til prøven røret.
- Sentrifuge eksempel røret 19.000 x g for 1 min, og fjern deretter nedbryting så mye som mulig.
- Seal røret med Parafilm og umiddelbart snapin-fryse det i flytende nitrogen. Lagre røret ved-80 ° C før lysate utarbeidelse.
4. protein isolasjon for massespektrometri
Merk: Protein isolasjon beskrevet her kan også brukes for andre analyser (f.eks, western blot).
- Legge til de samme mengder 0,5 mm zirkonium oksid perler og minst 2 x volumet av lysate buffer med en proteinasen hemmer cocktail frosne prøven.
Merk: Avbildet nematoder-til-protein korrelasjon analysene ble utført med 100 µL av bufferen. LC--MS-/ MS prøver ble lysed med 200 µL av bufferen. - Starte homogenizer for 1 min hastighet 9. Kontroller at prøvene er helt lysed. Gjenta dette trinnet hvis de ikke er fullt lysed.
- Sentrifuge prøvene i 30 min på 4 ° C 19.000 x g. Overføre nedbryting til en ny tube på is og lagre den på-80 ° C før videre målinger skal tas.
Merk: Ikke-denaturing bufferen for avbildet eksperimenter består av følgende substanser: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% Triton-X og 2 mM EDTA.
Merk: Har fulgt trinnene i denne protokollen og har brukt den foreslåtte skalaen, bør avkastningen av protein pellets fra ca 1000 nematoder være ca 500 µg. Hvis flere sammenligninger, se figur 2 og Representant resultater.
5. eksempel forberedelse for flytende kromatografi-tandem massespektrometri målinger
Merk: Avhengig av parameteren rundt eksempel utarbeidelsen vil variere. Denne protokollen fokuserer på methylglyoxal og alder besluttsomhet.
-
Måle intracellulær methylglyoxal av derivatization med 1,2-diaminobenzene (DB) som beskrevet tidligere9.
- Homogenize prøvene med 20 µL av iskalde 20% (wt/vol) Trekloredikksyre i 0,9% (wt/vol) natriumklorid og 80 µL av vann i en 1,5 mL tube.
- Spike utvalgene av 5 µL med interne standarden (13C3-MG, 400 nM), bland dem med vortexing og deretter virvel dem 21000 x g i 5 min på 4 ° C.
- Overføre 35 µL nedbryting av til HPLC eksempel ampullen inneholder en 200 µL Glassinnsatsen.
- Legge til 5 µL av 3% Natriumazid (wt/vol) hver prøve etterfulgt av 10 µL av 0,5 mM DB i 200 mM HCl med 0,5 mM diethylenetriaminepentaacetic syre (DETAPAC) i vann.
- Inkuber prøvene 4 h i romtemperatur, beskyttet mot lyset.
- Analysere prøvene av LC-MS/MS, som beskrevet tidligere9.
Merk: For måling av aldre, isolere proteiner som beskrevet i del 4 av protokollen.
-
Måle protein konsentrasjonen av den (tinte) lysates bruker en Bradford analysen10.
- Forberede dele 30 µL en standardkurve spiked med bovin serum albumin (BSA) løst i fosfat-bufret saltvann (PBS) av følgende konsentrasjonen: 0; 0.1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; og 1.0 mg/dL.
Merk: Hvis prøven var forberedt på de foreslåtte størrelsen (se trinn 4.1 for utarbeidelsen av lysate med 200 µL av buffer), beregnet konsentrasjonen bør være ca 2-7 mg/ml. I dette tilfellet fortynne prøver 1:10 med PBS før måling.
Merk: For de første eksperimentene ved hjelp av denne metoden, er det anbefalt å måle eksemplene i forskjellige fortynninger (1, 1:10 og 1: 100). Det er ingen nøyaktig bestemmelse av antall nematoder, kan avkastningen variere mellom forskere. - Bruke en gjennomsiktig 96-brønns plate (polystyren) og Pipetter 10 µL av hver standard konsentrasjon og eksemplene i de valgte fortynninger i duplikater i brønnene.
- Fortynne protein analysen fargestoff reagens konsentrat 1:5 med destillert vann (aq. dest.) og legge 200 µL av fortynning hvert utvalg på tallerkenen. Inkuber platen i 10 min ved romtemperatur.
- Måle absorbansen innen 30 minutter til 595 nm med en plate-leser. Eksemplene kan være interpolert fra beregnet standardkurven. Flere detaljer om metoden har blitt beskrevet mye i litteratur10.
- Forberede dele 30 µL en standardkurve spiked med bovin serum albumin (BSA) løst i fosfat-bufret saltvann (PBS) av følgende konsentrasjonen: 0; 0.1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; og 1.0 mg/dL.
-
Måle intracellulær tidene som beskrevet tidligere11,12.
- Vask totale protein ekstrakter (ca 200 µg) 3 x med vann ved ultracentrifugation i 10 kDa sentrifugal filter enheter.
- Legg til 10 µL av 100 mM HCl, 10 µL av pepsin (2 mg/mL i 20 mM HCl) og 10 µL av thymol (2 mg/mL i 20 mM HCl) til det gjenopprettede proteinet (ca 100 µL) og ruge prøvene ved 37 ° C i 24 timer.
- Nøytralisere og buffer prøvene ved pH 7.4 ved å legge til 12,5 µL 0,5 M kalium fosfat bufferen (pH 7.4) og 5 µL 260 mm KOH.
- Legge til 10 µL av Pronase E [2 mg/mL 10 mM kalium fosfat buffer (pH 7.4)] og 10 µL av en penicillin-streptomycin løsning, og Inkuber prøvene ved 37 ° C i 24 timer.
- Legge til 10 µL av aminopeptidase [2 mg/mL 10 mM kalium fosfat buffer (pH 7.4)] og 10 µL av prolidase [2 mg/mL 10 mM kalium fosfat buffer (pH 7.4)], og Inkuber prøvene ved 37 ° C i 48 timer.
- Analysere det resulterende hydrolysatet av LC-MS/MS, som beskrevet tidligere12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempler på å skape en storstilt C. elegans kultur her for programmer i diabetes forskningen presenteres. Det kan være av interesse å relatere parametrene til en enkelt dyr, snarere enn å normalisere den til den totale protein konsentrasjonen. En analysen som krever et lite antall nematoder, kan dette enkelt oppnås ved å telle nematoder. For en storstilt C. elegans kultur med hundrevis av nematoder per forsøksgruppen, denne tilnærmingen er upraktisk. I figur 2vises sammenhengen mellom hvor C. elegans og proteininnhold. Som vist her, reproduserbare kvantitative protein isolering oppnås ved hjelp av denne protokollen.
Amadori adduct fructosyl-lysin er en av flere alder forløpere dannet under diabetes i eksperimentelle dyr modeller13. Figur 3 viser LC--MS-/ MS mål etter en glukose behandling i 12 dager gamle nematoder og alder-matchet ubehandlet kontroller fra tre uavhengige eksperimenter. Nematoder ble homogenisert med et tillegg på 200 µL lysate bufferen. En økt dannelse av fructosyl-lysin etter høy-glukose behandling er presentert.
Reaktiv metabolitter som methylglyoxal er fluctuant og endre proteiner raskt14. Derfor gjenstår spørsmålet om disse reaktive metabolitter faktisk akkumuleres i organismen eller endres før de nådde sine mål. Figur 4 bekrefter akkumulering av methylglyoxal i C. elegans etter en behandling med stoffet.
Oksidativt stress øker under hyperglykemi6og skjæring stress. Figur 5 bekrefter ingen forskjell i dannelsen av oksidativt stress glukose-behandlet gruppen overføres som § 2 i protokollen, og gruppen ikke-overført. Sammenligning av både glukose-behandlet grupper ubehandlet kontrollgruppen viser en betydelig økning i oksidativt stress indusert av glukose. Derimot ble ingen signifikant forskjell mellom de to glukose-behandlet gruppene observert. Disse resultatene viser at håndtering nematoder bruker denne protokollen ikke betydelig indusere dannelsen av oksidativt stress, som kunne tjene som en confounder i undersøkelser av aldring eller stoffskifte. Videre ble funn i gjeldende litteratur reprodusert bruker denne protokollen.
Figur 1: tilstrekkelig tettheten av nematoder for en videre distribusjon på tallerkener. (A) dette panelet viser en makroskopisk visning. (B) dette panelet viser en microscopic utsikt, på 20 X augmentation. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Proteininnhold av vill-type C. elegans N2. Dette panelet viser sammenhengen antall nematoder til protein avkastningen av den lysate, forberedt som beskrevet under protokollen 5 i 12 dager gamle nematoder(n = 3 lysate av 500 nematoder; n = 3 lysate av 1000 nematoder; og n = 1 lysate av 1500 nematoder). Regresjonslinjen er merket i rødt (r2 = 0.976, y = 0.64). Totalt protein konsentrasjonen ble målt med metoden Bradford. Dataene uttrykkes som gjennomsnittlig ± standardavviket (SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Økt dannelse av fructosyl-lysin etter en glukose behandling av C. elegans N2. Konsentrasjonen av fructosyl-lysin etter behandling med glukose i 12 dager gamle nematoder og ubehandlet kontroller ble bestemt av LC--MS-/ MS og normalisert til en protein konsentrasjon bestemmes av metoden Bradford. Dataene blir uttrykt som den gjennomsnittlig ± SD. P-verdier ble fastsatt av Student t-test, **p < 0,01. Resultatene er fra tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Intracellulær methylglyoxal konsentrasjoner etter en methylglyoxal behandling av C. elegans N2. Methylglyoxal konsentrasjoner ble målt med LC--MS-/ MS i 12 dager gamle nematoder behandlet med methylglyoxal. Prøvene ble samlet mindre enn 2t etter siste behandling. Dataene uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD normalisert antall nematoder. P-verdier ble fastsatt av Student t-test, **p < 0,01. Resultatene er fra tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Oksidativt stress målt i C. elegans CL2166 etter en glukose behandling. Transgenic CL2166 (gst4::GFP)8 inneholder glutathione-S-transferase 4-promotor-drevet GFP reporter ble kultivert på 400 µM FUdR plater som inneholder glukose for 2 d. En gruppe ble overført til frisk glukose plater på dag 1 som beskrevet i del 2 av denne protokollen. Oksidativt stress ble målt som en økning i fluorescens [relative lette enheter (RLU)] med en plate-leser. Dataene blir uttrykt som den gjennomsnittlig ± SD. P-verdier ble fastsatt av ANOVA, *p < 0,05. Resultatene er fra tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen presenterer en pålitelig tilnærming for storskala dyrking av C. elegans hente kvantitative resultater. Funn fra litteraturen kan replikeres som vist i Representant resultater. Selv om denne protokollen for innsamling av store prøver C. elegans virker som en rett-fram-metoden, er det visse fallgruvene ta hensyn. Om synkroniseringen av befolkningen Rundormer beskriver denne protokollen tilnærming av bleking befolkningen med natriumhypokloritt og natriumhydroksid å ødelegge nematoder og høste eggene utelukkende. Det må tas i betraktning at denne tilnærmingen er egnet for alle eksperimentene. Avhengig av andelen av befolkningen størrelse volumet av bleking løsningen påvirker skade effekten av bleking løsningen utviklingen av embryo15. Spesielt når studere utviklingsprosesser, kan dette være et viktig skritt. Når det gjelder håndtering av nematoder er det avgjørende å bruke som lite skjær krefter som mulig gjennom protokollen. Dersom ikke håndteres med forsiktighet, vil et stort antall nematoder omkomme. For saks skyld er det viktig å ikke overskride spinning tid og hastighet. Ved overføring av nematoder, bør et kutt pipette tips å nedskrive antallet av skadde nematoder brukes. For overføring av nematoder, bør den anbefalte mengden buffer ikke overskrides, idet agar kan sprekk når det blir altfor fuktig, gir nematoder muligheten å grave i platen. Mens samle prøvene, må M9 bufferen holdes iskald tregere nematoder metabolisme, spesielt når du arbeider med metabolitter eller underlag som C. elegans vil forringe. Det er viktig å vaske prøven grundig for å minimere alle bakteriell forurensning fra tidligere mate. Ved overføring av pellets, husk at mange ormer kan holde seg til plast pipette-spisser. Anbefalte glass pipette bør brukes som selv lav-bindende pipette-spisser kunne beholde mye av utvalget. Som et alternativ foreslått tillegg av 0,01% Triton-X100 til den M9 bufferen var tidligere16. For å sikre at ingen avdøde C. elegans eller bakterier vil påvirke resultatene, utføres sukrose floatation etter samlingen av nematoder kan14. Dette gjøres vanligvis etter flytende dyrking for å fjerne mediet. I dette eksperimentet, ble denne rensing utelatt, fordi sukrose er metaboliseres til glukose og fruktose, dermed potensielt confounding våre resultater.
Vanligvis utføres en storstilt kultur C. elegans med flytende media. Flytende dyrking, men er ikke egnet for alle eksperimentelle innstillinger, særlig når benytter readouts som krever nøyaktig antall nematoder. En endring av Baerman apparatet ble tidligere beskrevet for å sortere og rense nematoder avledet fra flytende kultur17. Denne metoden stor grad reduserer bakteriell forurensning og filtrerer bare voksne nematoder gjennom en flere komponent filtersystem. Denne elegante metoden er begrenset av lenge filtrering tid (2-6 h) i romtemperatur, som kan forvirre metabolske analyser. Som for filtrering teknikken, er nematoder sortert etter deres flytting aktiviteter. Nematoder må være passe nok til å krype uavhengig gjennom porene i filtre fra ulike materialer. Resultater kan derfor forstyrres av unntatt nematoder som er svekket av eksperimentelle behandlinger.
Kombinere væske og plate kulturer i en enkelt eksperimentell design kan også tjene som en confounder i senere analyser. C. elegans utvikler en tynnere og lengre fenotypen i flytende kultur, gjør det vanskelig å sammenligne parametere normalisert til masse, proteininnhold eller kropp lengde og bredde2. Videre er studier av reaktive stoffer utfordrende i flytende kultur, siden reaktive stoffer vil sannsynligvis endres eller inaktivert av media komponentene før nematoder. Selv om store prøver C. elegans kan fås med denne protokollen, er plate kulturen selv mer arbeidskrevende enn flytende kultur. Men er det visse måter å lette håndteringen (f.eksmed bruk av en agar-dispensing maskin). Et annet alternativ å fremme omfattende kultur effektivt er bruk av Petri retter med en større diameter for produksjon av agar platene. Dette alternativet kan være begrensning av etterfølgende analysene. Mikroskopiske vurdering eller plate håndtering generelt, redusere fasiliteter med diameteren på parabol.
Flere høy gjennomstrømming tilnærminger egnet for vurdering av ulike parametere, for eksempel kjemiske eller narkotikarelaterte screening, har vært utviklet og undersøkt18. Microfluidic enheter kan forskere til å studere ulike parametere, som vist i en modell av type 2-diabetes19. Levetid, lipid metabolisme og oksidativt stress svar kan samtidig vurderes på en enkelt-dyr-nivå, avslørende fordelene med høyt innhold screening, som integrerer fenotypiske biokjemiske informasjon. Vurderingen av påliteligheten og reproduserbarhet av aktuell litteratur har allerede vist en stor avgrensning av disse teknikkene, går utover proof-of-concept studier18. Kostnader, spesielt for mindre laboratorier, fortsatt problematisk, da enhetene ofte måtte skreddersys etter eksperimentelle behov, som kan vise seg for å være kostbart.
Kvantifiseringen aldre i C. elegans kompliseres av ugjennomtrengelig styrke i Rundormer. En vanlig metode er deteksjon av alderen via immunofluorescent stainings6. På grunn av cuticle for større prøver størrelser å redusere høye avviket av resultatene. Bildebehandling må tas i betraktning som en tidkrevende faktor.
Protokollen for hele kroppen lysate forberedelse beskrevet her gjør intracellulær aldre og andre komponenter C. elegans tilgjengelig for analyser. LC--MS-/ MS målinger av C. elegans prøver er utført før14. Tilstrekkelig dyrking forhold, men har for å oppnå et tilstrekkelig antall nematoder, ikke blitt beskrevet i detalj, ennå.
Metoden beskrevet i denne protokollen er nyttig for readouts krever en storstilt, homogenously vokst befolkningen C. elegans, eller en kombinasjon av flere readouts per forsøk. Dette er spesielt nyttig for å studere komplekse multifaktoriell sykdommer som diabetes og sin komplikasjonene. Alternative tilnærminger, slik som høy gjennomstrømming og høyt innhold screening bruker microfluidic systemer, er mer teknologisk avanserte, og kan gi store data. Deres viktigste programmet ses i kjemisk og narkotikarelaterte screening eller genetisk screening for mutanter svarer på eksperimentell behandlinger. Denne protokollen hjelper forskere å lett og rimelig oppskalere størrelsen på deres nåværende eller fremtidige prosjekter uten behov for en justering av gjeldende eksperimentelle readouts og dermed å unngå tap av tid forbundet med etablering av nye metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) i IRTG 1874 "Diabetiker mikrovaskulær komplikasjoner" og CRC 1118 "Reaktive metabolitter som en årsak for diabetiker sent komplikasjoner". C. elegans stammer N2 og CL2166 ble levert av CGC, som finansieres ved NIH Office of forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 mm x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T.
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Nervous system, general description. WormAtlas. , Available from: http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html (2011).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
