Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

विभिन्न डाइसल्फ़ाइड Connectivities के साथ µ-Conotoxin PIIIA Isomers का संश्लेषण एवं संरचना निर्धारण

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58368
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Pharmaceutical Biochemistry and Bioanalytics, Pharmaceutical Institute, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Cysteine-रिच पेप्टाइड्स उनके डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी के आधार पर विशिष्ट तीन-आयामी संरचनाओं में गुना । बफ़र ऑक्सीकरण इच्छित डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी के लिए लीड नहीं है, जब व्यक्तिगत डाइसल्फ़ाइड isomers के लक्षित संश्लेषण की आवश्यकता है । 3 के चयनात्मक संश्लेषण के साथ प्रोटोकॉल सौदों-डाइसल्फ़ाइड-बंधुआ पेप्टाइड्स और उनके संरचनात्मक विश्लेषण का उपयोग कर एनएमआर और ms/

Abstract

cysteines की एक उच्च संख्या के साथ पेप्टाइड्स आमतौर पर उनके डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी द्वारा तीन आयामी संरचना के बारे में प्रभावित कर रहे हैं । यह एक पूरी तरह से अलग पेप्टाइड संरचना में परिणाम हो सकता है, क्योंकि यह इस प्रकार, पेप्टाइड संश्लेषण के दौरान अवांछित डाइसल्फ़ाइड बांड गठन से बचने के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है, और फलस्वरूप बदल गया है । हालांकि, एक पेप्टाइड में एकाधिक डाइसल्फ़ाइड बांड के सही गठन के लिए मानक स्वयं का उपयोग करके प्राप्त करने के लिए मुश्किल है-ऐसे पारंपरिक बफर ऑक्सीकरण प्रोटोकॉल के रूप में तह तरीकों, क्योंकि कई डाइसल्फ़ाइड connectivities का गठन किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल एक उंनत एकाधिक डाइसल्फ़ाइड-पाटने पेप्टाइड्स जो उच्च गुणवत्ता और मात्रा में बफर ऑक्सीकरण के माध्यम से संश्लेषित नहीं किया जा सकता के लक्षित संश्लेषण के लिए आवश्यक रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है । अध्ययन एक लक्षित तरीके से µ-conotoxin PIIIA के सभी संभव 3-डाइसल्फ़ाइड-बंधुआ पेप्टाइड isomers के संश्लेषण के लिए एक अलग रक्षा समूह रणनीति के आवेदन को दर्शाता है । पेप्टाइड्स परिभाषित डाइसल्फ़ाइड बांड गठन के लिए एक रक्षा समूह रणनीति का उपयोग Fmoc आधारित ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण द्वारा तैयार कर रहे हैं. cysteines के संबंधित जोड़े trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) के साथ संरक्षित कर रहे हैं, और tert-butyl (टीबु) समूहों की रक्षा के लिए सुनिश्चित करें कि हर ऑक्सीकरण कदम के दौरान ही आवश्यक cysteines असुरक्षित और जुड़े हुए हैं । लक्षित संश्लेषण के अलावा, कई विश्लेषणात्मक तरीकों का एक संयोजन सही तह और वांछित पेप्टाइड संरचनाओं की पीढ़ी को स्पष्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है । अलग 3-डाइसल्फ़ाइड-बंधुआ isomers की तुलना सटीक निर्धारण और तीन आयामी संरचना की गणना के लिए और जैविक की व्याख्या के लिए डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी के ज्ञान के महत्व को इंगित करता है पेप्टाइड isomers की गतिविधि । विश्लेषणात्मक लक्षण वर्णन मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस/एमएस) विश्लेषण जो आंशिक रूप से कम है और बरकरार पेप्टाइड isomer एक अनुकूलित प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित के alkylated डेरिवेटिव के साथ किया जाता है के माध्यम से सटीक डाइसल्फ़ाइड बांड elucidation भी शामिल है । इसके अलावा, पेप्टाइड संरचनाओं का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं 2d परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) प्रयोगों और ज्ञान से प्राप्त एमएस/

Introduction

दवा अनुसंधान और विकास में जैव सक्रिय पेप्टाइड्स का उपयोग अत्यधिक मांयता प्राप्त है, क्योंकि वे विशिष्ट जैविक लक्ष्य1के लिए शक्तिशाली और उच्च चयनात्मक यौगिकों का प्रतिनिधित्व करते हैं । अपनी गैर-सक्रियता के लिए, तथापि, तीन आयामी संरचना बहुत महत्व की है ताकि संरचना-गतिविधि संबंध अध्ययन2,3,4करने के लिए । प्राथमिक एमिनो एसिड अनुक्रम है कि समग्र अनुरूपता को प्रभावित करता है के अलावा, डाइसल्फ़ाइड बांड काफी cysteine-अमीर पेप्टाइड्स की संरचना को स्थिर5. मल्टीपल डाइसल्फ़ाइड-ब्रिजेड पेप्टाइड्स में कांउस purpurascens से µ-PIIIA जैसे conotoxins शामिल हैं जो इसके अनुक्रम में छह cysteines हैं । इस उच्च cysteine सामग्री सैद्धांतिक रूप से 15 डाइसल्फ़ाइड isomers के गठन की अनुमति देता है । 6,7जैविक गतिविधि के लिए सही डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी बहुत महत्वपूर्ण है । हालांकि, सवाल उठता है कि क्या वहां स्वाभाविक रूप से होने वाली पेप्टाइड्स के एक से अधिक जैव सक्रिय अनुरूप है और अगर ऐसा है, जो उन isomers के सबसे अधिक जैविक गतिविधि के पास? µ-conotoxins के मामले में, जैविक लक्ष्य वोल्टेज gated सोडियम आयन चैनल हैं, और विशेष रूप से µ-PIIIA नv१.२, ना v १.४ और ना v १.७3के लिएसबसे शक्तिशाली है ।

डाइसल्फ़ाइड-पाटने पेप्टाइड्स के संश्लेषण विभिन्न तरीकों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । एक पेप्टाइड के भीतर डाइसल्फ़ाइड बांड के गठन के लिए सबसे सुविधाजनक तरीका तथाकथित ऑक्सीडेटिव आत्म तह दृष्टिकोण है । यहां, वांछित चक्रीय पेप्टाइड के रैखिक अग्रदूत साबित पहले ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण, जो एक बफर प्रणाली में ऑक्सीकरण के अधीन बहुलक समर्थन से दरार के बाद है का उपयोग कर संश्लेषित है । Redox-सक्रिय एजेंटों जैसे कम और ऑक्सीकरण glutathione (GSH/GSSG) अक्सर डाइसल्फ़ाइड बांड के गठन को बढ़ावा देने के लिए जोड़ रहे हैं । बफर का मुख्य नुकसान-समर्थित आत्म तह है कि डाइसल्फ़ाइड बांड चुनिंदा एक stepwise फैशन में नहीं बना रहे हैं । देशी पेप्टाइड की तुलना में, जिसके लिए अक्सर केवल एक विशिष्ट डाइसल्फ़ाइड isomer का वर्णन किया गया है, यह8दृष्टिकोण के साथ कई अन्य isomers प्राप्त करने के लिए संभव है. µ-PIIIA पहले से ही कम में परिणाम दिखाया गया है तीन अलग ढंग से स्वयं पर जोड़ isomers-एक पिछले अध्ययन में तह3। इस तरह के एक isomer मिश्रण की जुदाई नहीं बल्कि मुश्किल है समान प्रतिधारण समय के कारण अगर क्रोमेटोग्राफिक शुद्धिकरण तरीकों का उपयोग कर9. एक विशिष्ट isomer के लक्षित संश्लेषण इसलिए लाभप्रद है । विशेष रूप से परिभाषित डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी के साथ एक isomer का उत्पादन करने के लिए, एक विशेष रणनीति की आवश्यकता है जिसमें डाइसल्फ़ाइड बांड क्रमिक बंद कर रहे हैं । इसलिए, रैखिक अग्रदूत व्यक्तिगत cysteine जोड़े पर अलग सुरक्षा समूहों ले जा बहुलक समर्थन पर संश्लेषित है । उंमूलन के बाद, cysteine जोड़े व्यक्तिगत और क्रमिक असुरक्षित है और एक ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया के लिए वांछित डाइसल्फ़ाइड बांड10,11,12,13उपज में जुड़ेहुए हैं, 14 , 15 , 16. संश्लेषण और प्रतिक्रिया उत्पाद की शुद्धि के बाद, यह पहचान और उपयुक्त विश्लेषणात्मक विधियों द्वारा डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है । कई विश्लेषणात्मक तरीकों प्राथमिक एमिनो एसिड अनुक्रम के elucidation के लिए उपलब्ध हैं, जैसे, एमएस/ms, जबकि डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी का निर्धारण अभी भी बहुत कम जांच की है । इसके अलावा इस तरह के एकाधिक डाइसल्फ़ाइड-बंधुआ पेप्टाइड्स की जटिलता से, उत्पाद से संबंधित अशुद्धियों (जैसे, डाइसल्फ़ाइड पांव मार से), नमूना तैयारी और काम अप के कारण विश्लेषण को जटिल कर सकते हैं. इस पत्र में, हम बताते है कि विभिंन विश्लेषणात्मक तकनीकों के संयोजन का उपयोग स्पष्ट µ-PIIIA isomers में डाइसल्फ़ाइड बांड की पहचान स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है । हम जन स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयुक्त क्रोमेटोग्राफिक तरीकों और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए एक ही नमूने प्रदान की है । मैट्रिक्स में असिस्टेड लेजर desorption/ionization (मालदी) ms/एमएस विश्लेषण, हम आंशिक कमी और iodoacetamide derivatization का उपयोग करके डाइसल्फ़ाइड बांड की पहचान की है क्योंकि ऊपर से नीचे विश्लेषण इस पेप्टाइड के लिए संभव नहीं है । 2d एनएमआर प्रयोगों के लिए प्रत्येक isomer के एक तीन आयामी संरचना प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया गया । इस प्रकार, अलग परिष्कृत विश्लेषणात्मक तरीकों के संयोजन से, यह डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी और जटिल एकाधिक डाइसल्फ़ाइड के तीन आयामी संरचना-बंधुआ पेप्टाइड्स7स्पष्ट ठीक से संभव है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: सभी अमीनो एसिड के साथ साथ इस्तेमाल किया एल विंयास में थे । IUB की नामकरण समिति और जैव रासायनिक नामकरण पर आईयूपीएसी-IUB संयुक्त आयोग की सिफारिशों के अनुसार एमिनो एसिड और एमिनो एसिड डेरिवेटिव का संक्षिप्त उपयोग किया गया ।

1. ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण (SPPS)

नोट: एक ठोस चरण पेप्टाइड सिंथेसाइज़र के साथ संश्लेषण बाहर ले. 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) रसायन विज्ञान के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर सामान्य अनुक्रम ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 के रेखीय पेप्टाइड पुरोगामी का संश्लेषण निष्पादित करें । निम्न रक्षित अमीनो अम्लों को लागू करें: Pyr (बीओसी (tert-butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (२, २, ४, ६, ७-pentamethyldihydrobenzofuran-५-sulfonyl)), Asn (Trt), एएसपी (tBu), Hyp (tBu), Lys (बीओसी), Ser (tBu), Gln (Trt), Glu (tBu), टीआरपी (बीओसी), Tyr (tBu), (tBu), और उनके (Trt) । इरादा डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी के अनुसार Trt-, Acm-, या टीबु-समूहों के साथ cysteine जोड़े को सुरक्षित रखें ।

  1. तैयारी
    1. सूखी Fmoc रिंक-राल के बीच (लोड हो रहा है: ०.२८ mmol/
    2. सिंथेसाइज़र के कार्यक्रम में वांछित पेप्टाइड अनुक्रम (1-पत्र कोड) दर्ज करें । कार्यक्रम हर व्यक्ति के एजेंट के लिए आवश्यक राशि की गणना और विलायक मात्रा को इंगित करता है ।
    3. व्यक्तिगत एजेंट वजन (अमीनो एसिड, HBTU (2-(एक-benzotriazol-1-yl)-1, 1, 3, 3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) प्रोटोकॉल के अनुसार और उंहें dimethylformamide (DMF) में २.४ मीटर (अमीनो एसिड) और ०.६ मीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए भंग ( HBTU), क्रमशः ।
    4. विभिन्न रिएजेंट (एमिनो एसिड, HBTU, एन methylmorpholine (NMM, DMF में ५०%), piperidine में (20% DMF), DMF, dichloromethane (डीसीएम)) इसी जहाजों के लिए स्थानांतरण और उन्हें ठोस चरण पेप्टाइड सिंथेसाइज़र के उपयुक्त गोरखधंधे में जगह है ।
    5. प्रतिक्रिया स्तंभों के लिए सूखी राल के १०० मिलीग्राम जोड़ें और उन्हें सिंथेसाइज़र के रैकेट में डाल दिया । ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण शुरू.
  2. SPPS-प्रोटोकॉल (सिंथेसाइज़र द्वारा प्रदान की)
    नोट: प्रोटोकॉल के लिए लागू होता है १०० राल के मिलीग्राम (लोड हो रहा है: ०.२८ mmol/जी) 28 µmol पैमाने के लिए एक प्रतिक्रिया कॉलम में जोड़ा ।
    1. राल की तैयारी
      1. DMF के २५०० µ एल के साथ राल कुल्ला, १४०० डीसीएम के µ एल, और १४०० µ एल के DMF ।
      2. हवा के साथ राल फ्लश जब तक विलायक हटा दिया जाता है और DMF के २५०० µ एल के साथ राल कुल्ला ।
    2. Fmoc protection group का क्लीवेज
      1. DMF में 20% piperidine जोड़ें (१००० µ एल) राल के लिए और 6 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें राल से समाधान निकालें. दोहराएँ चरण 1.2.2.1.
      2. DMF (1st ४००० µ एल, 2एन डी१४०० µ एल) के साथ दो बार कुल्ला, विलायक हटा दिया जाता है और DMF के २००० µ एल के साथ दो बार कुल्ला जब तक हवा के साथ राल फ्लश ।
    3. युग्मन प्रतिक्रिया
      1. निम्नलिखित रिएजेंट को एक अलग शीशी में मिलाएं: HBTU (४५० µ l; DMF में ०.६ मी; २७० µmol; ९.६ eq.), NMM (१२५ µ l; ५०% DMF में; ५६८ µmol; 20 eq.), Fmoc-अमीनो अम्ल (४२० µ l; २.४ मीटर में DMF; १.०१ mmol; ३६ eq.). राल के लिए मिश्रण जोड़ें और 13 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें राल से समाधान निकालें । दोहराएँ चरण 1.2.3.1.
      2. DMF के ३००० µ l से धो लें । DMF के १४०० µ l के साथ दो बार धोएं । DMF के २००० µ l के साथ दो बार धोएं ।
      3. दोहराएँ चरण 1.2.2 और 1.2.3 पेप्टाइड अनुक्रम में अमीनो एसिड की संख्या के अनुसार.
    4. अंतिम Fmoc दरार और राल धोने
      1. DMF में 20% piperidine जोड़ें (१००० µ एल) राल के लिए और 6 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें राल से समाधान निकालें. दोहराएँ चरण 1.2.4.1.
      2. DMF (1st ४००० µ एल, 2एन डी १४०० µ एल) के साथ दो बार कुल्ला और हवा के साथ राल फ्लश । DMF के २००० µ एल के साथ दो बार कुल्ला, १४०० डीसीएम के µ एल के साथ 4 बार, और हवा के साथ दो बार फ्लश ।
  3. काम-अप
    1. संश्लेषण पूर्ण होने के बाद प्रतिक्रिया स्तंभों से रात भर राल Lyophilize.

2. पेप्टाइड राल से दरार (चित्रा 1ए)

नोट: दरार प्रक्रिया के दौरान, Cys (Acm) और Cys (टीबु) के लिए छोड़कर सभी एमिनो एसिड पक्ष जंजीरों असुरक्षित हो जाएगा । प्रोटोकॉल राल के १०० मिलीग्राम के लिए लागू होता है ।

  1. एक 12 मिलीलीटर ट्यूब में फ्रीज सूख राल गठबंधन और बर्फ पर 0 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत ।
  2. एक मेहतर मिश्रण के १५० µ एल जोड़ें (०.७५ जी phenol, ०.५ मिलीलीटर thioanisole, ०.२५ मिलीलीटर ethanedithiol से तैयार) और trifluoroacetic एसिड की 1 मिलीलीटर (TFA, पानी में ९५% (H2O)) बर्फ पर राल के लिए । धीरे कमरे के तापमान पर 3 ज के लिए मिलाते हुए छोड़ दें ।
  3. एक गिलास frit के माध्यम से मिश्रण फ़िल्टर और व्यक्तिगत रूप से बर्फ ठंडा diethyl ईथर (diethyl ईथर के 8-10 मिलीलीटर प्रति क्लीवेज मिश्रण की 1 मिलीलीटर) से भरा ट्यूबों में निस्पंदन इकट्ठा । पेप्टाइड के रूप में एक सफेद ठोस हाला ।
  4. अतिरिक्त TFA (एच2ओ में ९५%, लगभग 1-3 मिलीलीटर) के साथ फिल्टर केक कुल्ला ।
  5. बंद तेज़ और केंद्रापसारक युक्त ट्यूबों (३४०० x g) 1 मिनट के लिए निलंबन, supernatant और बर्फ की 8-10 मिलीलीटर ठंड diethyl ईथर के साथ छर्रों धो । । । इस चरण को 3 बार दोहराएं ।
  6. diethyl ईथर के शेष निशान को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए डाट बिना खड़े छर्रों छोड़ दें । tertके 1 मिलीलीटर में कच्चे उत्पाद छर्रों भंग-ब्यूटानॉल (एच2ओ में ८०%) । फ्रीज-पेप्टाइड्स (-८० डिग्री सेल्सियस) सूखी ।

3. अर्द्ध preparative उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) के साथ रैखिक अग्रदूत की शुद्धि

नोट: अर्द्ध preparative रिवर्स चरण (आरपी) HPLC एक C18 कॉलम (5 µm कण आकार, १०० Å ताकना आकार, २५० x ३२ mm) और एक ३.६ एमएल इंजेक्शन लूप से सुसज्जित द्वारा कच्चे पेप्टाइड्स शुद्ध । ०.१% TFA की ग्रैडिएंट रेफरेंस प्रणाली का प्रयोग एच2ओ (eluent ए) और ०.१% TFA में acetonitrile (MeCN)/H2ओ (9:1, eluent बी) में करें । २२० एनएम पर चोटियों का पता लगाने ।

  1. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए क्रूड पेप्टाइड के लगभग ७० मिलीग्राम जोड़ें और HPLC नमूना पाश की मात्रा (जैसे, ३.६ एमएल) में ठोस पेप्टाइड भंग । MeCN/एच2ओ (1:1) में ०.१% TFA के मिश्रण का प्रयोग करें । भंवर जब तक पूरा विघटन और केंद्रापसारक (३४०० x g) 1 मिनट के लिए समाधान ।
  2. एक 5 मिलीलीटर सिरिंज में नमूना (३.६ एमएल) ड्रा और इंजेक्शन पाश में किसी भी हवा के बुलबुले के बिना नमूना सुई. HPLC प्रणाली में सुई । पेप्टाइड मिश्रण का उपयोग कर अलग से 0-50% eluent B पर १२० मिनट की एक प्रवाह दर पर 10 मिलीलीटर/
  3. व्यक्तिगत ट्यूबों में भागों इकट्ठा के रूप में वे दिखाई देते हैं । चलाने के पूर्ण होने के बाद, मास-स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) और HPLC विश्लेषण (चरण 6.1-6.2) के लिए चयनित अंशों को तैयार करें । अंशों को फ़्रीज़ करें और उन्हें-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कर दें.
  4. एमएस और HPLC विश्लेषण के बाद, रैखिक पेप्टाइड के शुद्ध अंशों गठबंधन और पहले ऑक्सीकरण के लिए नमूने तैयार.

4. डाइसल्फ़ाइड बांड के चयनात्मक गठन

  1. 1 एसटी ऑक्सीकरण (चित्रा 1बी)
    नोट:, Cys (Trt) राल से पेप्टाइड दरार के दौरान, दो असुरक्षित Cys अवशेषों जो बाद में पहले डाइसल्फ़ाइड बांड फार्म के ऑक्सीकरण के अधीन है करने के लिए अग्रणी रहे हैं । निंनलिखित प्रोटोकॉल के लिए लागू होता है 15 रैखिक शुद्ध पेप्टाइड की मिलीग्राम (२८६४.५ g/मोल; ५.२ µmol; 1 eq.) ।
    1. एक isopropanol/एच2ओ-मिश्रण के १०५ मिलीलीटर में रैखिक पेप्टाइड (15 मिलीग्राम) भंग (1:2; ०.०५ मिमी; पीएच ८.५ सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) के साथ समायोजित) और धीरे से मूल शर्तों के तहत हवा में मिलाते छोड़ 12-48 एच के लिए ।
    2. HPLC और सुश्री के माध्यम से ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया की निगरानी iodoacetamide (आईएए) derivatization (चरण 6) द्वारा पहले पुल के गठन की पुष्टि करें ।
    3. फ्रीज-पेप्टाइड सूखी और यह 2एन डी ऑक्सीकरण के लिए आगे शुद्धि के बिना उपयोग करें ।
  2. 2एन डी ऑक्सीकरण (चित्रा 1सी)
    नोट: दूसरे ऑक्सीकरण के दौरान, Acm-संरक्षित cysteines के संरक्षण और दूसरे पुल के गठन आयोडीन द्वारा catalyzed हैं । प्रोटोकॉल के लिए लागू होता है 15 पेप्टाइड की मिलीग्राम 1st ऑक्सीकरण के बाद (२८६२.५ g/मोल; ५.२ µmol; 1 eq.)
    1. एक isopropanol/एच2ओ/1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) मिश्रण (80:12.5:7.5) के १०५ मिलीलीटर में पेप्टाइड (15 मिलीग्राम; अंतिम एकाग्रता ०.०५ mM) का विघटन ।
    2. समाधान के लिए मेथनॉल (MeOH) (१५.७ µmol; 3 eq.) में एक ०.१ एम आयोडीन समाधान के १५८ µ एल जोड़ें । 3-52 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया हलचल, यानी, जब तक ऑक्सीकरण पूरा हो गया है ।
    3. HPLC और सुश्री के माध्यम से ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया की निगरानी iodoacetamide (आईएए) derivatization द्वारा दूसरा डाइसल्फ़ाइड बांड के गठन की पुष्टि (6 कदम) ।
    4. एच2ओ (७८.८ µmol; 15 eq.) में एक 1 एम ascorbic एसिड समाधान की ७९ µ एल जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो । फ्रीज-प्रतिक्रिया मिश्रण सूखी और 3आरडी ऑक्सीकरण के लिए पाउडर का उपयोग करें ।
  3. 3rd ऑक्सीकरण (चित्रा 1डी)
    नोट: पिछले ऑक्सीकरण टीबु संरक्षित cysteines के संरक्षण के लिए और तीसरे डाइसल्फ़ाइड पुल के गठन के लिए सुराग । प्रोटोकॉल के लिए लागू होता है 15 के बाद पेप्टाइड की मिलीग्राम 2एन डी ऑक्सीकरण (२७१८.३ g/मोल; ५.५ µmol; 1 eq.).
    1. TFA के ५.५ मिलीलीटर में पेप्टाइड (15 मिलीग्राम, 1 मिमी के अंतिम एकाग्रता) भंग । यह एक मेहतर मिश्रण शामिल diphenylsulfoxide के ११.२ मिलीग्राम (५५ µmol; 10 eq.), ६०.२ µ एल के anisole (०.६ mmol; १०० eq.) और ९७.२ µ एल के trichloromethylsilane (०.८ mmol; १५० eq.). कमरे के तापमान पर 3-5 ज के लिए मिश्रण हिलाओ ।
    2. HPLC और सुश्री के माध्यम से ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया की निगरानी iodoacetamide (आईएए) derivatization द्वारा तीसरे डाइसल्फ़ाइड बांड के गठन की पुष्टि (6 कदम) ।
    3. ठंड diethyl ईथर (0 डिग्री सेल्सियस, diethyl ईथर के 8-10 मिलीलीटर प्रति प्रतिक्रिया समाधान के 1 मिलीलीटर) युक्त ट्यूबों में पेप्टाइड हाला ।
    4. (३४०० एक्स जी, 1 मिनट), supernatant के लिए खिचड़ी भाषा का निलंबन केंद्रापसारक, और छर्रों धोने बार (4 बार) शीत diethyl ईथर के 8-10 मिलीलीटर (0 डिग्री सेल्सियस) के साथ । हवा (3 मिनट) पर छर्रों सूखी चलो ।
    5. ८०% tertके 1 मिलीलीटर में छर्रों भंग-ब्यूटानॉल (एच2ओ में), फ्रीज-पेप्टाइड और यह दुकान पर-20 ° c.

5. पेप्टाइड शुद्धि

नोट: अर्द्ध preparative आरपी HPLC एक C18 कॉलम (10 µm कण आकार, ३०० Å ताकना आकार, २५० x 22 मिमी) और एक ३.६ मिलीलीटर इंजेक्शन पाश से सुसज्जित द्वारा ऑक्सीकरण पेप्टाइड्स शुद्ध । एच2ओ (eluent ए) और ०.१% TFA में MeCN/एच2ओ (9:1, eluent बी) में ०.१% TFA की ग्रैडिएंट रेफरेंस प्रणाली का प्रयोग करें । २२० एनएम पर चोटियों का पता लगाने ।

  1. 15 मिलीग्राम की फ्रीज-एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए कदम 4.3.5 से सूखे कच्चे उत्पाद जोड़ें । HPLC नमूना पाश की मात्रा में कच्चे उत्पाद को भंग (जैसे, ३.६ मिलीलीटर). MeCN/एच2ओ (1:1) में ०.१% TFA के मिश्रण का प्रयोग करें । भंवर जब तक पूरा विघटन और केंद्रापसारक (३४०० x g) 1 मिनट के लिए समाधान ।
  2. एक 5 मिलीलीटर सिरिंज में ३.६ मिलीलीटर मिश्रण ड्रा और इंजेक्शन पाश में किसी भी हवा के बुलबुले के बिना नमूना सुई. HPLC प्रणाली में इंजेक्शन शुरू करते हैं । पेप्टाइड 0-50% eluent बी के एक ढाल 10 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर १२० मिनट से अधिक का उपयोग कर मिश्रण शुद्ध/
  3. व्यक्तिगत ट्यूबों में भागों इकट्ठा के रूप में वे दिखाई देते हैं । चलाने के पूर्ण होने के बाद, MS और HPLC विश्लेषण (चरण 6.1-6.2) के लिए चयनित अंशों को तैयार करें । फ्रीज-सभी भागों सूखी और उन पर दुकान-20 डिग्री सेल्सियस ।
  4. चलाने के पूर्ण होने के बाद, MS और HPLC विश्लेषण (चरण 6.1-6.2) के लिए चयनित अंशों को तैयार करें । फ्रीज-सभी भागों सूखी और उन पर दुकान-20 डिग्री सेल्सियस ।

6. पेप्टाइड विश्लेषिकी

  1. विश्लेषणात्मक HPLC
    नोट: एक C18 कॉलम (5 µm कण आकार, ३०० Å ताकना आकार, २५० x ४.६ मिमी) और एक ५०० µ एल इंजेक्शन पाश के साथ सुसज्जित विश्लेषणात्मक आरपी HPLC द्वारा एक पेप्टाइड की शुद्धता की पुष्टि करें । MeCN (eluent बी) में एच2ओ (eluent ए) और ०.१% TFA में ०.१% TFA की ग्रैडिएंट रेफरेंस प्रणाली का प्रयोग करें । २२० एनएम पर चोटियों का पता लगाने ।
    1. एक HPLC शीशी में पेप्टाइड भिन्न या प्रतिक्रिया नियंत्रण का एक नमूना स्थानांतरित और MeCN/H2O (1:1, 300-500 µ l) में ०.१% TFA का एक मिश्रण में इसे भंग. विश्लेषणात्मक आरपी HPLC के पारखी में HPLC शीशी रखें ।
    2. प्रत्येक नमूने के २५० µ एल इंजेक्षन । MeCN (eluent बी) में एच2ओ (eluent ए) और ०.१% TFA में ०.१% TFA की ग्रैडिएंट रेफरेंस प्रणाली का प्रयोग करें । 10-40% eluent बी के एक ढाल का उपयोग कर पेप्टाइड शुद्ध १.० मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर 30 मिनट/
  2. मालदी तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री
    नोट: मैट्रिक्स के रूप में α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड का उपयोग कर मालदी तोफ (उड़ान का समय) मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा एक पेप्टाइड की पहचान की पुष्टि करें ।
    1. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में पेप्टाइड की एक दृश्यमान राशि स्थानांतरण और यह 10 µ एल में भंग एक ३७ मिमी α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड समाधान के मिश्रण में ०.१% TFA में एच2ओ/MeCN (1:1).
    2. भंवर 10 एस के लिए समाधान, एक जमीन इस्पात लक्ष्य के लिए नमूने के 2 µ एल लागू करें, और हवा सूखी नमूना ।
    3. माप के लिए चिंतनशील मोड का उपयोग करें और दाढ़ जनता के लिए एक पेप्टाइड अंशांकन मानक ६००० g/
  3. Iodoacetamide derivatization
    नोट: thiol समूहों के साथ iodoacetamide प्रतिक्रिया के रूप में, iodoacetamide derivatization के पेप्टाइड्स मुक्त thiol समूहों को इंगित करता है । इसलिए, मुफ्त thiol समूहों के अभाव एमएस के माध्यम से एक प्रतिक्रिया नियंत्रण के रूप में कार्य करता है 1st ऑक्सीकरण के दौरान ।
    1. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 10 मिमी फॉस्फेट बफर (१०० µ एल; ०.०५ मिमी; पीएच ७.८) में पेप्टाइड भंग । 10 mm फॉस्फेट बफर में iodoacetamide के १०० µ एल जोड़ें (4 मिमी) पेप्टाइड समाधान के लिए और धीरे अंधेरे में कमरे के तापमान पर 2 ज के लिए प्रतिक्रिया हिला । फ्रीज-प्रतिक्रिया मिश्रण सूखी और-20 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।
    2. ८०% (3 बार), ५०% (3 बार), 30% (3 बार) और 0% (3 बार) MeCN में एच2ओ (+ ०.१% TFA) के 10 µ एल के साथ एक C18-एकाग्रता फिल्टर पिपेट टिप और शर्त का प्रयोग करें ।
    3. चरण 6.3.1 से नमूना भंग 1 µ l में ०.१% TFA के एच2में हे और फिल्टर पिपेट टिप करने के लिए समाधान जोड़ें. पिपेट ध्यान से ऊपर और नीचे इतना है कि पेप्टाइड मोतियों को बांधता है । पिपेट टिप से एच2ओ बाहर निकालें और एच2ओ में ०.१% TFA के 10 µ एल के साथ फिल्टर पिपेट टिप कुल्ला ।
    4. जोड़ें 2 µ एल में ०.१% TFA के एच2ओ/MeCN (1:1) के साथ एक और पिपेट टिप (बिना फिल्टर) के ऊपर पर मनका जो पेप्टाइड शामिल हैं । जमीन स्टील लक्ष्य और हवा-सूखी नमूना करने के लिए निस्पंदन लागू करें ।
    5. एक ३७ mM α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड समाधान के 1 µ एल के एक मिश्रण में लागू ०.१% TFA में एच2ओ/MeCN (1:1) नमूना और एयर-ड्राई नमूना के साथ जमीन स्टील लक्ष्य के लिए ।
    6. माप के लिए चिंतनशील मोड का उपयोग करें और दाढ़ जनता के लिए एक पेप्टाइड अंशांकन मानक ६००० g/
  4. एमिनो एसिड विश्लेषण
    नोट: सटीक पेप्टाइड एकाग्रता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक एमिनो एसिड विश्लेषक का उपयोग पेप्टाइड के एमिनो एसिड संरचना का विश्लेषण.
    1. स्थानांतरण १०० µ जी का शुद्ध पेप्टाइड (२६०४ g/मोल; ०.०४ µmol) के लिए एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और 6 एम एचसीएल के २०० µ एल में पाउडर भंग ।
    2. एक गिलास शीशी में समाधान के २०० µ एल स्थानांतरण और 6 एम एचसीएल के २०० µ एल के साथ दो बार १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब कुल्ला । के रूप में अच्छी तरह से गिलास शीशी में कुल्ला समाधान स्थानांतरण ।
    3. एक Bunsen बर्नर लौ के साथ शीशी की गर्दन हीटिंग द्वारा शीशी बंद करो । एक ग्लास ट्यूब में शीशी रखो । यह hydrolysis के लिए ११० डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए एक हीटिंग ब्लॉक में रखें ।
    4. शीशी खोलें और एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में समाधान हस्तांतरण । शीशी (3 x २०० µ l) और कैप (3 x १०० µ l) को डबल-आसुत एच2ओ के साथ धोएं और इसे microcentrifuge ट्यूब में ट्रान्सफर करें ।
    5. ६० डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए समाधान केंद्रापसारक और २१० एक्स जी में एक घूर्णन निर्वात ध्यानी । नमूना कमजोर पड़ने बफर (२०० µ मीटर) के १९२ µ एल में hydrolyzed उत्पाद को भंग करने और एक माइक्रो-केंद्रापसारक फिल्टर में समाधान हस्तांतरण ।
    6. २३०० x जी पर 1 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक और एक एमिनो एसिड विश्लेषण नमूना ट्यूब में छानने का १०० µ एल हस्तांतरण । एमिनो एसिड विश्लेषक में ट्यूब प्लेस और विश्लेषण शुरू करते हैं । एक एमिनो एसिड मानक अंशांकन के लिए प्रयोग किया जाता है ।

7. एमएस/एमएस डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी का विश्लेषण

  1. आंशिक कमी और alkylation17
    1. विशुद्ध पेप्टाइड के ६०० µ g को भंग करना (२६०४ g/मोल; ०.२३ µmol) ०.०५ एम साइट्रेट बफर की १.२ मिलीलीटर में (pH ३.०; ०.१४ mM पेप्टाइड एकाग्रता) युक्त ७.५ मिलीग्राम tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP; ०.०२ m; ०.०३ mmol) ।
    2. कमरे के तापमान पर मिश्रण मशीन और कई प्रतिक्रिया नियंत्रण नमूने (१०० µ एल) 0 मिनट से लेकर 30 मिनट के लिए ले ।
    3. alkylation बफर के ३०० µ एल के साथ एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में नमूने मिश्रण (०.५ एम tris-एसीटेट; पीएच ८.०; 2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA); १.१ मीटर iodoacetamide) प्रतिक्रिया को रोकने के लिए और मुक्त carbamidomethylation समूहों के thiol प्रदर्शन करते हैं ।
    4. 10% TFA (एच2ओ में) के १०० µ एल जोड़कर 5 मिनट के बाद प्रतिक्रिया बंद करो और सूखी बर्फ पर नमूनों की दुकान । चरण 6.1.2 में वर्णित के रूप में HPLC नमूने तैयार करें और ४०० µ l सुई (चित्रा 2ए)
    5. MeCN (eluent बी) में एच2ओ (eluent ए) और ०.१% TFA में ०.१% TFA की ग्रैडिएंट रेफरेंस प्रणाली का प्रयोग करें । विश्लेषण एक isocratic जुदाई के संयोजन का उपयोग कर पेप्टाइड्स (10% eluent बी 15 मिनट के लिए) और फिर 10 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर 25 मिनट से अधिक 10-35% eluent बी के बाद के ढाल/२२० एनएम पर चोटियों का पता लगाने ।
    6. १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों और फ्रीज-में अंशों इकट्ठा पेप्टाइड्स सूखी । (चित्रा 2बी)
    7. ऑक्सीकरण रूपों के एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए प्रत्येक अंश की एक छोटी राशि हस्तांतरण (कदम 7.1.12 पर जारी) ।
    8. शेष पेप्टाइड (10-100 µ g) को h2o (10-50 µ l) में ०.१% TFA में भंग करें और 10 मिमी की अंतिम TCEP एकाग्रता प्राप्त करने के लिए १०० mm TCEP सॉल्यूशन (एच2ओ में) की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें ।
    9. ३७ डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2सी) में 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया की मशीन । फ्रीज-प्रतिक्रिया मिश्रण सूखी और-20 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।
    10. एमएस/एमएस नमूने चरण 6.3.2-6.3.5 में वर्णित के रूप में तैयार करें ।
    11. एक मालदी तोफ/तोफ सामूहिक स्पेक्ट्रोमीटर पर ms/ उपयोग एमएस/एमएस ढक्कन (लेजर प्रेरित क्षय) पेप्टाइड के विखंडन के लिए और 2-और 4-बार carbamidomethylated प्रजातियों के प्रणेता जनता का चयन करें । प्रक्रिया और वांछित डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी की पुष्टि करने के लिए मालदी डेटा का मूल्यांकन ।

8. एनएमआर प्रयोगों और संरचना विश्लेषण

  1. भंग लगभग 0.3-2 एच2ओ के ५०० µ एल में शुद्ध पेप्टाइड उत्पाद की मिलीग्राम/डी2ओ (90:10) और एक एनएमआर microtube में मिश्रण हस्तांतरण ।
  2. एक एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर पर माप के लिए नमूना तैयार करें
  3. रिकॉर्ड 2-आयामी [1h,1h]-DQF-मधुर (डबल क्वांटम छान सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी), [1ज,1ज]-TOCSY (कुल संबंधित स्पेक्ट्रोस्कोपी), [1ज,1ज]-NOESY (नाभिकीय Overhauser संवर्धन स्पेक्ट्रोस्कोपी), और [1एच,13सी]-HSQC (heteronuclear एकल क्वांटम जुटना) स्पेक्ट्रा पानी दमन का उपयोग कर ।
  4. दर्ज स्पेक्ट्रा के प्रोटॉन अनुनादों निरुपित और NOESY स्पेक्ट्रा से एटम असाइनमेंट बनाने. पेप्टाइड में विभिन्न परमाणुओं के बीच ऊपरी-सीमा दूरी की बाधाओं को सेट करने के लिए NOESY स्पेक्ट्रा में तीव्रता की तुलना करें । पीक तीव्रता अंशांकन के लिए कीटाणु प्रोटान की तीव्रता का उपयोग करें ।
  5. आणविक visualizing के लिए एक कंप्यूटर प्रोग्राम के साथ संरचना गणना और शोधन प्रदर्शन और अतिरिक्त संयम (चित्रा 3) के रूप में 7 कदम की पहचान की डाइसल्फ़ाइड connectivities का उपयोग करें ।
  6. सबसे कम ऊर्जा के साथ संरचनाओं का चयन करें और आणविक गतिशीलता (एमडी) सिमुलेशन के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

15 विभिन्न डाइसल्फ़ाइड-पाटनी isomers के µ-conotoxin PIIIA संश्लेषित और विस्तार में विशेषता है (चित्रा 1). डाइसल्फ़ाइड बांड आंशिक कमी और बाद में एमएस/एमएस विश्लेषण (चित्रा 2) द्वारा की पहचान कर रहे हैं । अलग isomers के एनएमआर विश्लेषण बाहर किया जाता है (चित्रा 3) व्यक्तिगत पेप्टाइड संरचनाओं प्रकट करने के लिए । विशेष रूप से, आरपी HPLC, एमएस/एमएस विखंडन, और एनएमआर विश्लेषण का एक संयोजन डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी की अस्पष्ट पहचान के लिए आवश्यक है ।

Figure 1
चित्रा 1 : देशी µ के चयनात्मक डाइसल्फ़ाइड बांड गठन-रक्षा समूह रणनीति के माध्यम से PIIIA । (क) राल से पेप्टाइड दरार के दौरान Trt संरक्षित cysteines के संरक्षण । (ख) असुरक्षित cysteines के प्रथम डाइसल्फ़ाइड सेतु का गठन । (ग) Acm संरक्षित cysteines के संरक्षण और डाइसल्फ़ाइड सेतु का गठन. (घ) टीबु रक्षित cysteines के संरक्षण और डाइसल्फ़ाइड सेतु का गठन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : एमएस/एमएस विश्लेषण द्वारा डाइसल्फ़ाइड बांड असाइनमेंट के लिए आंशिक कमी कार्यप्रवाह । (क) आंशिक कमी और alkylation पेप्टाइड का. (ख) विभिन्न प्रतिक्रिया नियंत्रण नमूनों का HPLC शुद्धिकरण. (ग) शुद्धि के नमूनों में कमी । आंशिक रूप से carbamidomethylated प्रजातियों (बीच में दो पेप्टाइड) डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी जो एमएस/एमएस विश्लेषण द्वारा निर्धारित है पर जानकारी हार्बर । यह आंकड़ा Heimer, पी एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है । गठन µ-Conotoxin PIIIA Isomers फिर से आना: Cysteine पर डाइसल्फ़ाइड बाँधना का प्रभाव-बॉण्ड असाइनमेंट और संरचना Elucidation. विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान। ९० (5), 3321-3327 (२०१८). कॉपीराइट (२०१८) अमेरिकन केमिकल सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : अनुक्रमिक चलना और एक कठोर (बाएं) और एक लचीला (सही) µ-PIIIa isomer के परिणामस्वरूप एनएमआर समाधान संरचना । सबसे कम ऊर्जा के साथ 20 संरचनाओं के साथ ही विभिन्न isomers की डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी दिखाई जाती है । जड़ मतलब वर्ग विचलन (RMSD) मूल्यों की तुलना स्पष्ट है कि एक कठोर पेप्टाइड ज्यादातर एक बेहतर हल एनएमआर संरचना की ओर जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

विधि cysteine के संश्लेषण के लिए यहां वर्णित µ-PIIIA जैसे अमीर पेप्टाइड्स के लिए चुनिंदा एक ही एमिनो एसिड अनुक्रम से डाइसल्फ़ाइड बंधुआ isomers उत्पादन की संभावना का प्रतिनिधित्व करता है । इसलिए, Fmoc-आधारित ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण के रूप में स्थापित विधियों18 और डाइसल्फ़ाइड बांड के regioselective गठन के लिए एक परिभाषित रक्षा समूह रणनीति16इस्तेमाल किया गया । ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण स्वचालित संश्लेषण के माध्यम से एक बहुलक समर्थन (राल) पर अमीनो एसिड दृश्यों का उत्पादन कर सकते हैं । इन अमीनो एसिड के लिए अवांछित पक्ष प्रतिक्रियाओं के खिलाफ उनके पक्ष चेन, जो कर रहे हैं पर विशेष सुरक्षा समूहों द्वारा अनुक्रम विधानसभा के दौरान संरक्षित कर रहे हैं-इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है-राल से पेप्टाइड दरार पर असुरक्षित. इस सुरक्षा भी पेप्टाइड श्रृंखला के भीतर cysteine पक्ष श्रृंखला के लिए लागू होता है, जैसे, trityl संरक्षण । हालांकि, इस तरह के acetamidomethyl और tert-butyl के रूप में cysteines के व्यक्तिगत जोड़े के लिए अलग रक्षा समूहों concomitantly इस उंमूलन कदम के माध्यम से नहीं सट रहे हैं । इन समूहों की रक्षा शर्तों के तहत बंद कर दिया जा सकता है जो असुरक्षित thiol समूहों से डाइसल्फ़ाइड बांड बनाने के बाद ऑक्सीकरण की अनुमति देते हैं । इस तरह, छह cysteine अवशेषों युक्त एक पेप्टाइड के सभी 15 डाइसल्फ़ाइड isomers चुनिंदा7,16का गठन किया जा सकता है । सीमित कारक है, तथापि, यह है कि विभिंन ओर्थोगोनल की बढ़ती संख्या के साथ समूहों की रक्षा सिंथेटिक प्रयास बढ़ जाती है, जो वांछित डाइसल्फ़ाइड पाटने पेप्टाइड की उपज पर एक उच्च प्रभाव पड़ता है । इस प्रकार, चयनित मामलों में और कम जटिल पेप्टाइड्स केवल एक या दो डाइसल्फ़ाइड बांड रखने के लिए विशेष रूप से ऑक्सीडेटिव आत्म तह दृष्टिकोण वास्तव में रक्षा समूह की रणनीति पर पसंद किया जा सकता है ।

साथ ही, एक cysteine जोड़ी के Trt समूहों पेप्टाइड विधानसभा और अंतिम Fmoc एन टर्मिनल अमीनो एसिड के संरक्षण के पूरा होने के बाद TFA की कार्रवाई से हटा रहे हैं । अंलीय शर्तों, तथापि, Acm और टीबु cysteine अवशेषों के अंय दो जोड़े पर रक्षा समूहों को बरकरार छोड़ दें । बाद में, दो असुरक्षित cysteines युक्त रैखिक पेप्टाइड का शुद्धिकरण protonated रूप में thiol समूहों को बनाए रखने के लिए थोड़ा अम्लीय स्थितियों के तहत preparative HPLC का उपयोग किया जाता है. प्रोटोकॉल विश्लेषणात्मक HPLC और एमएस विश्लेषण के बाद पहली ऑक्सीकरण कदम के साथ जारी है सत्यापित सफल संश्लेषण और ब्याज की cysteine जोड़ी में Trt के संरक्षण । दूसरे और तीसरे डाइसल्फ़ाइड बांड के संरक्षण और ऑक्सीकरण के आगे कदम बाहर किया जाता है और उसी तरह Acm और टीबु, क्रमशः के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल का उपयोग कर में पुष्टि की । इन ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाओं इस प्रकार सरल गीला-रासायनिक प्रतिक्रियाओं का समाधान है जो महंगा रिएजेंट की आवश्यकता नहीं है में प्रदर्शन कर रहे हैं । नुकसान, तथापि, यह है कि कुछ प्रतिक्रियाओं, यानी, अलग cysteine अवशेषों के कनेक्शन, सुचारू रूप से आगे बढ़ना नहीं है और पूरी तरह से तले हुए डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी के उत्पादों के लिए अग्रणी. चूंकि ये व्यक्तिगत ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाओं के पूरा होने के बाद नहीं हटा रहे हैं, इस तरह के द्वारा उत्पादों कच्चे उत्पाद के मिश्रण में जमा कर सकते हैं । इनमें से कुछ वास्तविक पेप्टाइड, जैसे, HPLC रेफरेंस के रूप में समान भौतिक गुण के अधिकारी हो सकते हैं, जो सही ढंग से मुड़े पेप्टाइड की शुद्धि के लिए प्रयास को बढ़ाता है । हालांकि संश्लेषण और शुद्धि मुश्किल हो सकता है, के रूप में µ-PIIIA के लिए मामला है, इस विधि सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है, अभी तक अच्छा मार्गदर्शन और प्रेक्षण कौशल की आवश्यकता है । अंत में, यह विचार किया जा करने की जरूरत है कि हर पेप्टाइड अनुक्रम अलग है और इसलिए सही डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी पैदा करने में सफल होने के क्रम में भिन्न तरीके से इलाज किया जा सकता है.

चुनौतीपूर्ण संश्लेषण के अलावा, यह सत्यापित करने के लिए कि डाइसल्फ़ाइड बांड का उत्पादन सही हैं, अर्थात्, संबंधित डाइसल्फ़ाइड isomer के इच्छित संस्करण का प्रतिनिधित्व करने के लिए आवश्यक है । इस के साथ साथ किया जाता है मालदी एमएस का एक संयोजन/एमएस विश्लेषण और एनएमआर संरचना elucidation का उपयोग कर । एमएस/एमएस विश्लेषण अलग आंशिक रूप से कम और alkylated डेरिवेटिव (carbamidomethylation) का उपयोग कर बाहर किया जाता है पूरी तरह से ऑक्सीकरण पेप्टाइड17. मालदी ms/ms लिड तोफ/तोफ स्पेक्ट्रा में carbamidomethylated cysteines की एक सम संख्या हमेशा पाई जाती है, अर्थात, 2-, 4-या 6-बार carbamidomethylated । यह पूरी तरह से ऑक्सीकरण पेप्टाइड्स की stepwise कमी से समझाया जा सकता है, के बाद से प्रत्येक अवसर में दो डाइसल्फ़ाइड बांड प्रति thiol कार्यों हमेशा कम कर रहे है (खोला) और सीटू alkylated में iodoacetamide का उपयोग कर । दो cysteines के इस carbamidomethylation मालदी ms/ms स्पेक्ट्रा में पता लगाया जा सकता है और, बारी में, संबंधित डाइसल्फ़ाइड बंधन को संदर्भित करता है इन cysteines बरकरार पेप्टाइड में लगे थे । उदाहरण के लिए, तीन डाइसल्फ़ाइड बांड के साथ एक अनुक्रम में चार carbamidomethylated cysteines की घटना एक विशिष्ट बांड, अर्थात् दो गैर alkylated cysteines, जो की प्रतिक्रिया समय के दौरान नहीं खोला गया के बीच गठित एक की पहचान करने में मदद करता है आंशिक कमी अंय दो बांड खोलने के लिए पर्याप्त है । इस प्रकार, मालदी एमएस/एमएस विश्लेषण द्वारा विभिंन 2-और 4 बार carbamidomethylated डेरिवेटिव के पेप्टाइड डाइसल्फ़ाइड isomer, डाइसल्फ़ाइड connectivities पूरी तरह से आविर्भाव और पुष्टि की जा सकती है ।

डाइसल्फ़ाइड बांड पैटर्न स्पष्ट करने के लिए एक और संभावना enzymatically पचता पेप्टाइड्स के एमएस/एमएस विश्लेषण है, जहां पेप्टाइड छोटे टुकड़े का उत्पादन करने के लिए अलग अमीनो एसिड पर सट proteolytically किया जा करने के लिए है । इन छोटे टुकड़े अभी भी डाइसल्फ़ाइड बांड के माध्यम से जोड़ा जा सकता है, जो कारण है कि डाइसल्फ़ाइड पैटर्न एमएस से आविर्भाव किया जा सकता है/ µ-PIIIA के मामले में हालांकि यह रणनीति लागू नहीं की जा सकी क्योंकि परिक्रमा के कुछ cysteines एक दूसरे से सीधे सटे हुए हैं और इसलिए पेप्टाइड्स का पाचन एक दूसरे से cysteines को अलग नहीं करता । विशिष्ट डाइसल्फ़ाइड पुल की पहचान इसलिए कठिन है ।

2 डी एनएमआर विश्लेषण द्वारा elucidation संरचना स्पष्ट रूप से एक ज्ञात डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी के मामले में सुविधा है, क्योंकि यह ज्ञान विशिष्ट NOE, अर्थात्के लिए परमाणु Overhauser प्रभाव (प्रोटान) के काम को सक्षम बनाता है, स्थानिक की चर्चा करते हुए NOESY संकेतों की तीव्रता से निर्धारित दो परमाणुओं के बीच दूरी (के माध्यम से अंतरिक्ष एनएमआर प्रयोग). विश्लेषण, तथापि, अनुक्रमिक चलने के साथ शुरू होता है19 मधुर, TOCSY और NOESY स्पेक्ट्रा के लिए आवेदन किया, इस तरह से, यह इसी एच के लिए एक विशिष्ट संकेत असाइन करने के लिए संभव है, इस अनुक्रम में अमीनो एसिड (स्पिन प्रणाली) के एटम । aforementioned दूरी NOESY प्रयोग से संयमित पेप्टाइड7की संरचना की गणना में उपयोग किया जाता है । अधिक संकेतों की पहचान की, और अधिक सटीक संरचना हो जाएगा । हालांकि, इस काम की कठिनाई पेप्टाइड में अमीनो एसिड की संख्या और आसंन cysteines की घटना के साथ बढ़ जाती है, के रूप में संभावना बढ़ जाती है कि कई परमाणुओं के संकेत ओवरलैप और अब ठीक बंद होने के कारण सौंपा जा सकता है निकटता. इसके अलावा, पेप्टाइड श्रृंखला के लचीलेपन के लिए निर्णायक है कि एनएमआर में संकेत आसानी से या शायद ही पहचाने जाने योग्य हैं । अधिक लचीला एक पेप्टाइड क्षेत्र है, और अधिक संरचना परिवर्तन होने वाली हैं, कई संकेतों को एक और एक ही एटम के लिए प्राप्त करने की अनुमति । इस प्रकार, तीव्रता संरचनाओं की संख्या के साथ कम हो जाती है, जो पृष्ठभूमि शोर में गायब करने के लिए संकेतों का कारण बनता है. इसका मतलब यह है कि तीन आयामी संरचना elucidation एनएमआर के माध्यम से बहुत आसान हो जाता है अगर अनुक्रम को विवश है ।

अंत में, इस प्रोटोकॉल यह मालदी एमएस द्वारा डाइसल्फ़ाइड बॉण्ड गठन की निगरानी द्वारा एकाधिक डाइसल्फ़ाइड-पाटने पेप्टाइड्स उत्पन्न करने के लिए संभव बनाता है/ms विश्लेषण और सहवर्ती 2d एनएमआर संरचना elucidation7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Bruker Daltonics GmbH ब्रेमेन से ए. Resemann, एफ जे मेयर, और डी. Suckau का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे; डी. Tietze, ए. ए. Tietze, वी. श्मिट और सी. Thiele से Darmstadt विश्वविद्यालय प्रौद्योगिकी; ओ. Ohlenschläger से FLI जेना, एम. Engeser बॉन विश्वविद्यालय से; के. क्रेमर, ए. Harzen, और एच. Nakagami फॉर द मैक्स प्लैंक इंस्टिट्यूट फॉर प्लांट ब्रीडिंग रिसर्च, कोलोन; जूलॉजी, कोलोन के लिए संस्थान से सुसैन Neupert; और तकनीकी सहायता, प्रशिक्षण मॉड्यूल, और उपकरणों के लिए उपयोग के लिए फ्रैंकफर्ट के विश्वविद्यालय के आणविक चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी सुविधाओं । D.I. के लिए बॉन विश्वविद्यालय द्वारा वित्तीय सहायता आभार स्वीकार किया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
Pyr(Boc) Bachem A-3850
Arg(Pbf) Iris Biotech FSC1010
Asn(Trt) Bachem B-1785
Asp(tBu) Iris Biotech FSP1020
Hyp(tBu) Iris Biotech FAA1627
Lys(Boc) Bachem B-1080
Ser(tBu) Iris Biotech FSC1190
Gln(Trt) Iris Biotech FSC1043
Glu(tBu) Iris Biotech FSP1045
Trp(Boc) Iris Biotech FSC1225
Tyr(tBu) Sigma Aldrich 47623
Thr(tBu) Iris Biotech FSP1210
His(Trt) Iris Biotech FDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat Sigma Aldrich 8510060 Flammable
DMF Fisher Scientific D119 Flammable, Toxic
DCM Fisher Scientific D37 Carcinogenic
Piperidine Alfa Aesar A12442 Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-Morpholin Sigma Aldrich 224286
Cys(Acm) Iris Biotech FAA1506
Cys(Trt) Bachem E-2495
Cys(tBu) Bachem B-1220
trifluoruacetic acid Sigma Aldrich 74564 Toxic, Corrosive
phenol Merck 1002060 Toxic
thioanisol Alfa Aesar A14846
ethanedithiol Fluka Analytical 2390
diethyl ether VWR 100,921 Flammable
tert-butanol Alfa Aesar L12338 Flammable
acetonitrile Fisher Scientific A998 Flammable
water Fisher Scientific W5
isopropanol VWR ACRO42383 Flammable
sodium hydroxide AppliChem A6579,1000 Corrosive
iodoacetamide Sigma Aldrich I6125
iodine Sigma Aldrich I0385
Hydrochloric acid Merck 110165 Corrosive
ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
diphenylsulfoxide Sigma Aldrich P35405
anisol Sigma Aldrich 96109 Flammable
trichloromethylsilane Sigma Aldrich M85301 Flammable
sample dilution buffer Laborservice Onken
sodium dihydrogen phosphate Sigma Aldrich 106370
disodium hydrogen phosphate Sigma Aldrich 795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706
citric acid Sigma Aldrich 251275
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
tris-acetate Carl Roth,  7125
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E26282 
peptide calibration standard II Bruker Daltonics GmbH 8222570
Name of Equipment Company
solid-phase peptide synthesizer Intavis Bioanalytical Instruments AG EPS 221
lyophilizer  Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLC Jasco system PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) Knauer 25QE181E2J purification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) Hichrom-VWR HICH218TP1022 purification of the oxidized peptide
analytical HPLC  Shimadzu system LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm)  Hichrom-VWR HICH218TP54 analytical column
ground steel target (MTP 384) Bruker Daltonics GmbH NC0910436 MALDI preparation 
C18-concentration filter (ZipTip) Merck KGaA ZTC18S096 MALDI preparation 
MALDI mass spectrometer Bruker Daltonics GmbH ultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzer Eppendorf-Biotronik GmbH LC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance III Bruker Daltonics GmbH Bruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualising YASARA Biosciences GmbH Yasara structures NMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation  Bruker Daltonics GmbH flexAnalysis, BioTools MS/MS fragmentation
analog vortex mixer VWR VM 3000
Microcentrifuge Eppendorf 5410
Centrifuge Hettich EBA 20
Rotational vacuum concentrator Christ 2-18 Cdplus
Analytical Balance A&D Instruments GR-202-EC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
  2. Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  3. Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
  4. Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
  5. Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
  6. Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
  7. Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
  8. Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
  9. Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
  10. Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
  11. Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
  12. Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
  13. Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
  14. Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
  15. Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
  16. Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
  17. Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
  18. Kates, S. A., Albericio, F. Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , Marcel Dekker Inc. New York. (2000).
  19. Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).

Tags

रसायन विज्ञान अंक १४० पेप्टाइड्स cysteine-रिच डाइसल्फ़ाइड कनेक्टिविटी संश्लेषण रक्षा समूह रणनीति संरचना विश्लेषण 2d एनएमआर (परमाणु चुंबकीय अनुनाद) ms/ms (मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री)

Erratum

Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for:Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resin Novabiochem 855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
विभिन्न डाइसल्फ़ाइड Connectivities के साथ µ-Conotoxin PIIIA Isomers का संश्लेषण एवं संरचना निर्धारण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, … More

Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, C. A., Imhof, D. Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. J. Vis. Exp. (140), e58368, doi:10.3791/58368 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter