Summary
Die vorliegende Studie beschreibt ein Zebrafish Embryos Modell zur in-vivo Visualisierung und intravitalen Analyse von Biomaterial-assoziierten Infektionen im Laufe der Zeit anhand der Fluoreszenz-Mikroskopie. Dieses Modell ist ein viel versprechende Ergänzung Säugetier-Tiermodellen wie Maus-Modellen für das Studium Biomaterial-Infektionen in-vivo.
Abstract
Biomaterial-assoziierten Infektionen (BAI) ist eine der Hauptursachen für das Scheitern der Biomaterialien/medizinische Geräte. Staphylococcus Aureus ist einer der wichtigsten Erreger in BAI. Aktuelle Tiermodelle experimentelle BAI Säugetier-wie Maus-Modellen sind kostspielig und zeitaufwendig und daher nicht geeignet für Hochdurchsatz-Analyse. Somit sind neuartige Tiermodellen als ergänzende Systeme für die Untersuchung von BAI in-vivo erwünscht. In der vorliegenden Studie, wir wollten ein Zebrafish Embryos Modell zur in-vivo Visualisierung und intravitalen Analyse der bakteriellen Infektion in Anwesenheit von Biomaterialien, die anhand der Fluoreszenz-Mikroskopie zu entwickeln. Darüber hinaus wurde die Antwort provoziert Makrophagen untersucht. Zu diesem Zweck wir fluoreszierende Protein exprimierenden S. Aureus und transgenen Zebrafisch-Embryonen auszudrücken fluoreszierende Proteine in ihre Makrophagen verwendet und entwickelt ein Verfahren um Bakterien alleine oder zusammen mit Mikrosphären in den Muskel injizieren Gewebe von Embryonen. Um bakterielle Infektion Fortschreiten in live Embryonen im Laufe der Zeit zu überwachen, entwickelten wir eine einfache, aber zuverlässige Methode der mikroskopischen Punktwertung von fluoreszierenden Bakterien. Die Ergebnisse von mikroskopischen scoring hat gezeigt, dass alle Embryonen mit mehr als 20 Koloniebildenden Einheiten (KBE) von Bakterien eine positive Fluoreszenzsignal von Bakterien ergab. Um die potenziellen Auswirkungen der Biomaterialien auf Infektion zu untersuchen, haben wir die KBE Zahlen von S. Aureus mit und ohne 10 µm-Mikrokügelchen aus Polystyrol (PS10) als Modell Biomaterialien in den Embryonen festgestellt. Darüber hinaus haben wir ObjectJ-Projektdatei "Zebrafisch-Immunotest" im ImageJ um der Fluoreszenzintensität der S. Aureus -Infektion mit und ohne PS10 im Laufe der Zeit zu quantifizieren. Beide Methoden die Ergebnisse zeigten höhere Zahlen von S. Aureus in infizierten Embryonen mit Mikrosphären als bei Embryonen ohne Mikrosphären, zeigt eine Infektion erhöhte Anfälligkeit im Beisein der Biomaterial. So zeigt die vorliegende Studie das Potenzial des Modells Zebrafish Embryos, BAI mit den hier entwickelten Methoden zu studieren.
Introduction
Eine Vielzahl von medizinischen Geräten (bezeichnet als "Biomaterialien") werden zunehmend in der modernen Medizin verwendet, um wiederherstellen oder ersetzen menschlichen Körper Teile1. Die Implantation von Biomaterialien prädisponiert jedoch ein Patient zu Infektion, genannt ein Biomaterial-assoziierten Infektionen (BAI), ist eine schwere Komplikation der Implantate in der Chirurgie. Staphylococcus Aureus und Staphylococcus Epidermidis sind zwei am weitesten verbreitete Bakterienarten verantwortlich für BAI2,,3,4,5,6. Implantiert Biomaterialien Form eine Oberfläche anfällig für bakterielle Biofilmbildung. Darüber hinaus können lokale Immunantwort durch die implantierten Biomaterialien, verursachen Effizienzverluste bakterielle Clearance gestört werden. Die anfängliche Clearance von Bakterien infizieren erfolgt hauptsächlich durch die Infiltration von Neutrophilen, die stark reduzierte bakterizide Kapazitäten im Beisein eines eingefügten oder Biomaterialien7implantiert. Außerdem töten Makrophagen das Gewebe infiltrieren, nachdem der erste Zustrom von Neutrophilen die verbleibenden Bakterien phagozytieren werden aber nicht effektiv intrazellulär, durch gestörte immunen signalisieren, die eine Folge der kombinierten Anwesenheit ist Das Biomaterial und Bakterien8. So, das Vorhandensein von Biomaterialien intrazelluläre Überleben der Bakterien9,10,11,12,13 und Biofilm Formation auf den implantierten ermöglichen Biomaterialien4,14. Infolgedessen kann BAI führen zum Ausfall und müssen für den Austausch von implantierten Biomaterialien verursacht erhöhte Morbidität und Mortalität und längeren Krankenhausaufenthalt mit zusätzlichen Kosten2,15.
Eine wachsende Zahl von Anti-BAI-Strategien werden entwickelt,2,16,17. In-vivo Bewertung der Wirksamkeit dieser Strategien in relevanten Tiermodellen ist unerlässlich. Traditionelle experimentelle BAI Tiermodellen (z. B., -Maus-Modellen) sind jedoch in der Regel teuer, zeitaufwendig und daher nicht geeignet für hohen Durchsatz testen mehrere Strategien18. Aktuelle Entwicklung der Bio-optische bildgebende Verfahren basierend auf Biolumineszenz/fluoreszierend Etikettierung von Wirtszellen und Bakterien können sich für die kontinuierliche Überwachung der BAI Progression und Wirt-Pathogen/Host-Material Interaktionen in einzelne kleine Tiere wie Mäuse18,19,20,21. Aber diese Technik ist relativ komplex und noch in den Kinderschuhen, und mehrere Fragen zur quantitativen Analyse von BAI18. Zum Beispiel ist eine hohe Herausforderung-Dosis erforderlich, um bakterielle Besiedlung zu visualisieren. Darüber hinaus Licht Streuung und Adsorption von Biolumineszenz/Fluoreszenz-Signale in Geweben von Säugetieren Test, die Tiere müssen auch sein angesprochen18,19,21. Daher sind neuartige, kostengünstige Tiermodellen zulassend intravitalen Visualisierung und Quantitative Analyse im Laufe der Zeit wertvolle ergänzende Systeme für das Studium BAI in-vivo.
Zebrafisch (Embryonen) dienten als ein vielseitiges in-vivo Werkzeug für sezieren Wirt-Pathogen Interaktionen und Pathogenese der Infektion mehrere Bakterienarten wie Mykobakterien22, Pseudomonas Aeruginosa23, Escherichia coli24, Enterococcus Faecalis25und Staphylokokken26,27. Zebrafisch-Embryonen haben viele Vorteile wie optische Transparenz, eine relativ niedrige Instandhaltungskosten und Besitz des immunen Systems sehr ähnlich dem in Säugetieren28,29. Zebrafisch-Embryonen wird dadurch eine hohe Wirtschaftlichkeit, lebendigen Modellorganismus für intravitalen Visualisierung und Analyse der Infektion Fortschreiten und damit verbundenen Host Antworten28,29. Visualisierung der Zelle Verhalten in vivo, transgenen Zebrafisch Linien mit verschiedenen Arten von Immunzellen (z.B., Makrophagen und Neutrophile) und sogar mit Gewebekulturen tagged subzellulären Strukturen wurden entwickelt28 ,29. Darüber hinaus bietet die hohe Reproduktionsrate der Zebrafisch die Möglichkeit der Entwicklung von Hochdurchsatz-Testsysteme mit automatisierten Roboter-Injektion, automatisierte Fluoreszenz Quantifizierung und RNA Sequenz Analyse27, 30.
In der vorliegenden Studie hatten wir vor, ein Zebrafish Embryos Modell für Biomaterial-assoziierten Infektionen mit Fluoreszenz bildgebende Verfahren entwickeln. Zu diesem Zweck haben wir ein Verfahren um Bakterien (S. Aureus) injizieren in Anwesenheit von Biomaterial Mikrosphären in das Muskelgewebe von Zebrafisch-Embryonen entwickelt. Wir verwendeten S. Aureus RN4220 mit dem Ausdruck ihrer mCherry fluoreszierendes Protein (S. Aureus- mCherry), die gebaut wurde, wie an anderer Stelle für ein anderes S. Aureus -Stamm10,31beschrieben. Die transgenen Zebrafisch-Linie (mpeg1: FH/Kaede) Kaede grünes fluoreszierendes Protein in der Makrophagen32 und blau fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokügelchen dienten zum Ausdruck zu bringen. In einer früheren Studie haben wir gezeigt, dass intramuskuläre Injektion von Mikrosphären in Zebrafisch-Embryonen, Biomaterial Implantation zu imitieren machbar33. Um das Fortschreiten der BAI und damit verbundenen Zelle eindringen in einzelnen Embryonen im Laufe der Zeit quantitativ zu analysieren, haben wir die "Zebrafisch-Immunotest" Projektdatei, die in "ObjectJ" (ein Plug-in für ImageJ) betrieben wird, die Fluoreszenzintensität der Quantifizierung Bakterien, die ihren Wohnsitz und Makrophagen in der Nähe der Injektionsstelle der Mikrosphären33infiltrieren. Darüber hinaus bestimmen wir die Zahl der Koloniebildenden Einheiten (KBE) von Bakterien in an- und Abwesenheit von Mikrosphären in den Embryonen, mögliche Auswirkungen von Biomaterialien auf Infektion zu studieren. Unsere Studie zeigt, dass mit den hier entwickelten Methoden Zebrafish Embryos eine vielversprechende, Roman vertebrate Tiermodell für das Studium Biomaterial-Infektionen in-vivo.
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Protocol
In diesem Protokoll ist Pflege von Erwachsenen Zebrafisch in Übereinstimmung mit den lokalen Tierschutzbestimmungen wie von der lokalen Tierschutz-Ausschuss genehmigt. Experimente mit Embryonen wurden nach der Richtlinie 2010/63/EG durchgeführt.
1. Vorbereitung des "Nur-Bakterien" und Bakterien-Mikrosphären Suspensionen
Hinweis: Der S. Aureus RN4220 Stamm mit dem Ausdruck mCherry fluoreszierendes Protein (S. Aureus- mCherry) wird verwendet. S. Aureus RN4220 Belastung in der Virulenz Regulator-gen AgrA (Zubehör gen Regler A)34mutiert und kann daher relativ geringer Virulenz im Zebrafish Embryos Modell haben. Andere S. Aureus -Stämme oder andere Bakterienarten für BAI können verwendet werden.
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Nehmen Sie 4 bis 5 Kolonien von S. Aureus RN4220 Bakterien aus tryptic Soja Kultur Agarplatten mit 10 µg/mL Chloramphenicol ergänzt und Kultur die Bakterien Mitte logarithmischen Wachstumsphase in 10 mL tryptic Soja Brühe ergänzt mit 10 µg/mL Chloramphenicol bei 37 ° C unter schütteln.
- Während Kultur, verdünnen 100 µL Bakteriensuspension in 900 µL steriler Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in eine Küvette (Breite 1 cm) für eine optische Dichte (OD) Messung bei 620 nm (OD620). Kultur der Bakterien bis OD620 0,4 – 0,8 erreicht.
Hinweis: In der Regel entspricht ein OD-620 von 0,1 3,0 x 107 KBE/mL S. Aureus. Die OD-620 von einem Inokulum von Bakterien in Mitte logarithmischen Wachstumsphase ist zwischen 0,4-0,8. Unterschiedliche Zeiträume zur Kultivierung können für andere Arten und Stämme von Bakterien benötigt werden.
- Während Kultur, verdünnen 100 µL Bakteriensuspension in 900 µL steriler Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in eine Küvette (Breite 1 cm) für eine optische Dichte (OD) Messung bei 620 nm (OD620). Kultur der Bakterien bis OD620 0,4 – 0,8 erreicht.
- Bakterien bei 3.500 X g für 10 min Zentrifugieren und erneut aussetzen der gebeizte Bakterien in 1 mL sterile PBS. Anschließend waschen Sie die Bakterien mit sterilen PBS 2 Mal, und schließlich wieder auszusetzen Sie, die Bakterien in 1,1 mL 4 % (w/V) Polyvinylpyrrolidon40 (PvP-40) Lösung mit PBS-Puffer.
- Vortex diese Bakteriensuspension und verdünnte 100 µL der Suspension in 900 µL steriler PBS in einer Küvette für die OD-620 -Messung. Passen Sie die Konzentration der Bakteriensuspension mit PvP-40 Lösung. Dies ist die "Nur-Bakterien" Federung.
- Biomaterialien können frei gewählt werden, um mit Bakteriensuspension mischen. In der vorliegenden Studie werden kommerzielle Polystyrol (PS) Mikrosphären (blau fluoreszierend, 10 µm) verwendet. Um eine Bakterien-Mikrosphären Aussetzung zu generieren, Zentrifugieren Sie die Mikrosphären für 1 min bei 1000 X g, Raumtemperatur, verwerfen Sie den Überstand und erneut unterbrechen Sie die Mikrosphären in der "Nur-Bakterien" Suspension (in PVP40 Lösung).
- Die Konzentration der Bakterien-Mikrosphären Aussetzung muss um etwa gleiche Dosen von Bakterien in der Gegenwart und in der Abwesenheit von Mikrosphären injizieren, werden zwei Drittel des Zusammenschlusses der "Nur-Bakterien" Suspension (ohne Mikrosphären). Dies wird erreicht durch die Bakterien-Mikrosphären Aussetzung mit 0,5 Volumen der PvP-40 Lösung verdünnen. Mischen Sie die Suspensionen durch vortexen. Beachten ist ist dieses Verhältnis für S. Aureus(zwei Drittel) bewertet worden. Es eignet sich auch für S. Epidermidis, aber es wird empfohlen, zu prüfen, ob dieses Verhältnis gilt auch für andere Bakterienarten und andere Größen (unter 10 µm) oder Formen von Biomaterialien (als Mikrosphären) injiziert werden.
- Die Konzentration der "Nur-Bakterien" und Bakterien-Mikrosphären Suspension durch quantitative Kultur 10-divisibel serielle Verdünnungen wie folgt überprüfen: Transfer 100 µL der Suspensionen auf eine 96-Well-Platte und seriell verdünnt durch die Übertragung von 10 µL-Aliquots von der Federung in 90 µL steriler PBS. Doppelte 10 µL Aliquots der unverdünnten und verdünnten Suspensionen auf Agarose Platten Teller, über Nacht die Platten bei 37 ° C inkubieren, zählen der Kolonien und berechnen Sie die Anzahl der Bakterien (Koloniebildenden Einheiten. CFU).
(2) Zucht, Ernte und Pflege von Zebrafish Embryos
- Folgen Sie der allgemeinen Verfahren beschrieben früheren35,36 für Zucht, Ernte und Wartung von Zebrafisch-Embryonen, mit nachfolgend beschriebenen Modifikationen. Eine Familie von Wildtyp Tupfel lange Flosse (TL) Zebrafisch oder Zebrafisch der ausgewählten transgene Linie zu überqueren (hier, Mpeg1: Kaede) in einem Tank mit einem Netz hinzugefügt induzieren die erwachsenen Weibchen, Eier zu produzieren, nachdem das Licht anmacht, dann Erwachsene von der produzierten Eier trennen.
- Sammeln Sie die Embryonen am nächsten Tag zu und entsorgen Sie die undurchsichtigen, die nicht lebensfähig sind. Halten Sie ca. 60 Embryonen pro Petrischale (100 mm Durchmesser) in E3 mittlere37 und inkubieren Sie bei 28 ° C. Tot und abnorme Embryonen zu entfernen, und das E3-Medium täglich aktualisieren.
3. Vorbereitung der Injektionsnadeln
- Bereiten Sie die Glas Microcapillary Nadeln zur Injektion mit einer Mikropipette Puller Instrument. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Hitze: 772, ziehen: 100, Vel: 200, Zeit: 40, Gas: 75.
- Brechen Sie die Nadelspitze mit der Pinzette an der Stelle wo die Nadel einen Außendurchmesser von ca. 20 µm (für 10 µm Mikrosphären) hat, mit einem Lichtmikroskop mit eine Maßstabsleiste in das Okular. Vermeiden Sie Nadeln mit einer sehr großen Öffnung Größe, wie sie überleben des Embryos gefährden werden.
Hinweis: Die Öffnung kann gewählt werden, zu kleiner oder größer sein, je nach Größe und Form der Biomaterialien injiziert werden. In der Literatur berichteten Injektionen mit Nadeln mit einer Öffnung von ca. 50 µm, verursachen eine signifikante Abnahme der Embryo überleben38.
4. Injektion von "Bakterien-Only" oder Bakterien-Mikrosphären Aussetzung in Zebrafish Embryos
- Erhitzen Sie Agarose-Lösung (1 – 1,5 % (wt) in Demi-Wasser) mit einer Mikrowelle ausgestattet und in einer 100-mm-Petrischale gießen. Legen Sie eine Kunststoff-Formenbau-Vorlage auf die Agarose-Lösung in der Petrischale, Vertiefungen in der Agarose für die Platzierung der Embryonen in richtige Position erleichtern Injektionen zu schaffen. Bei Raumtemperatur inkubieren Sie und entfernen Sie den Schimmel, wenn die Agarose-Lösung erstarrt ist.
- Stellen Sie in 3-d nach Befruchtung die Embryonen in einer 100 mm Petrischale mit 0,02 % (w/V) 3-Aminobenzoic Säure (Tricaine), um sie zu betäuben. Nach 5 min transfer der Embryonen auf die Agarose-Platte mit E3 0,02 % (w/V) Tricaine-haltigem Medium überlagert und richten Sie sie in eine Orientierung für die Injektion. Für die Mpeg1: Kaede transgene Linie zuerst betäuben Embryonen in E3 mittlere mit 0,02 % (w/V) Tricaine. Wählen Sie dann die Embryonen grün fluoreszierende Proteine mit einem Stereo-Fluoreszenzmikroskop zum Ausdruck zu bringen.
-
Laden Sie die Nadel mit ca. 10 µL der "Bakterien-only" oder Bakterien-Mikrosphären Suspension mit einer Pipettenspitze Microloader. Montieren Sie die Nadel auf einem Mikromanipulator zum Mikro-Injektor verbunden. Für der Injektor hier (siehe Tabelle der Materialien), die folgenden Einstellungen für Injektionen von 2 – 3 nL verwendet: Druck: 300-350, Gegendruck: 0, Zeit: 2 ms.
Hinweis: Die Einstellungen für die Mikro-Injektor hängen den Injektor verwendet. Injektor-Einstellungen müssen für Injektionen von Bakterien gemischt mit Biomaterialien mit anderen Formen oder Größen angepasst werden.- Nadeln mit der gleichen Öffnung für die Injektion von "Nur-Bakterien" Federung und die Bakterien-Mikrosphären Aussetzung zu verwenden. Wenn die Nadel defekt oder verstopft ist, immer für eine neue Nadel für weitere Injektionen zu ändern.
- Stechen Sie die Nadel in das Muskelgewebe der Embryonen unter einem Lichtmikroskop (Abbildung 1), in einem Winkel von 45 – 60 ° c zwischen der Nadel und dem Körper des Embryos. Passen Sie die Position der Nadel im Gewebe durch sanft hin und her bewegt. Die Embryonen mit einem Fußpedal zum Mikro-Injektor verbunden zu injizieren.
- Zählen Sie nach Injektion von fluoreszierenden Bakterien die Embryonen für erfolgreiche Infektion unter dem Stereo-Fluoreszenzmikroskop. Entsorgen Sie die Embryonen erzielte negativ (keine sichtbaren fluoreszierenden Bakterien oder keine sichtbaren fluoreszierenden Mikrosphären). Embryonen einzeln in E3 Medium in 48-Well Platten zu erhalten. Aktualisieren Sie das Medium täglich.
(5) Zerkleinerung von Embryonen, mikroskopische Scoring und quantitativen Kultur von Bakterien
- Ergebnis aller Embryonen mikroskopisch auf das Vorhandensein von fluoreszierenden Bakterien mit einem Stereo-Fluoreszenzmikroskop, ab sofort nach den Injektionen und an jedem folgenden Tag bis die Embryonen für quantitative Kultur nach dem Zufallsprinzip ausgewählt werden.
- Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie ein paar live infizierten Embryonen (5 bis 6 in der vorliegenden Studie) kurz nach der Injektion und übertragen Sie sie einzeln auf separaten 2 mL Mikroröhrchen mit sterilen Tipps. Entfernen Sie das Medium, die Embryonen vorsichtig mit sterilen PBS einmal waschen und 100 µL steriler PBS hinzufügen.
- Jedes Fläschchen 2 – 3 sterile Zirkonia Perlen (2 mm Durchmesser) hinzu und zerquetschen die Embryonen mit der Homogenisator (siehe Tabelle der Materialien) bei 3.500 u/min für 30 s. Kultur das Homogenat quantitativ wie unter Punkt 1.3 beschrieben.
Hinweis: Anderen Homogenisatoren können andere Einstellungen erforderlich. - Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie mehrere Embryonen an den folgenden Tagen nach der Injektion für quantitative Kultur gemäß Schritt 5.3 aus.
(6) Fluoreszenzmikroskopie Infektion Fortschreiten und provoziert Cell Infiltration in den Zebrafish Embryos
- Betäuben Sie die Embryonen, wie unter Punkt 4.2 beschrieben. Pipette 500 µL einer PBS - 2 % (wt)-Methyl-Zellulose-Lösung in eine Petrischale mit E3 Medium mit 0,02 % (w/V) Tricaine. Legen Sie die Embryonen in die Methyl-Zellulose-Lösung und halten Sie sie gerade und horizontal.
Hinweis: Methyl-Zellulose-Lösung wird als ein "Klebstoff", der aufgrund seiner Viskosität vorübergehend immobilisieren können Embryonen in beste Orientierung für die Bildgebung verwendet. - Verwendung eines Stereo-Fluoreszenzmikroskop ausgestattet mit Hellfeld, mCherry, grün fluoreszierendes Protein (GFP) und UV Filter Bild einzelnen Embryonen unter identischen optimierte Einstellungen (z.B., Intensität, Gewinn und Belichtung Zeit) bei 160 X Vergrößerung . Die Brennebene so eingestellt, dass die Gewebeschädigung durch die Injektion verursacht im Fokus, mit dem Hellfeld-Filter ist. Stellen Sie die Z-Stapel Tiefe bei 10 µm und Schritt Größe bei 5 µm, die Aufnahme von 3 aufeinander folgenden Bildern ermöglicht.
- Bild einzelnen Embryonen einmal täglich von 5 h nach der Injektion bis 2 Tage nach der Injektion. Schließen Sie Toten Embryonen (kein Herzschlag oder Embryo teilweise abgebaut) für weitere imaging und Analyse. Embryonen einzeln in E3 Medium in 48-Well Platten zu erhalten. Aktualisieren Sie das Medium täglich.
(7) Quantitative Analyse der Fluoreszenzintensität der Infektion Fortschreiten und provoziert Cell Infiltration mit Objekt J Projektdatei "Zebrafisch-Immunotest"
- Der Link "Zebrafisch-Immunotest" und das ausführliche Handbuch herunterladen: < Https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, wie in einer früheren Studie33beschrieben. In Kürze öffnen Sie Bilder für die Analyse mit "Zebrafisch-Immunotest", unter dem Freeware-Programm Bild J. Jede geladene Bild manuell markieren der Injektionsstelle anhand der beobachteten Gewebeschäden von Embryonen.
Hinweis: Die markierte Seite dient "Zebrafisch-Immunotest" als den Mittelpunkt den Fluoreszenz-Gipfel innerhalb einer Entfernung von 50 µm zu erkennen. Die detektierten Fluoreszenz-Spitze dient dann als Zentrum eines standardisierten Bereichs (Durchmesser von 100 µm) für Fluoreszenzmessung. - Klicken Sie auf "Berechnung" im Menü Objekt J um die Fluoreszenz Messung für mehrere Kanäle, ggf. automatisch für alle Bilder laufen. Exportieren Sie die Daten und analysieren Sie, indem Sie geeignete statistische Testmethoden.
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Representative Results
Die vorliegende Studie untersucht die Anwendbarkeit der Zebrafisch-Embryonen als eine neuartige vertebrate Tiermodell für die Untersuchung von Biomaterial-assoziierten Infektionen. Mikroinjektion Technik ist häufig verwendet worden, um verschiedene Bakterienarten in Zebrafisch-Embryonen verursachen Infektion22,26,27,30,36zu injizieren. Mit dem Verfahren in Abbildung 1dargestellt, wurden S. Aureus allein oder zusammen mit 10 µm PS Mikrosphären (PS10) in injiziert das Muskelgewebe der Zebrafisch-Embryonen in der vorliegenden Studie. Intramuskuläre Injektion von S. Aureus verursachte Dosis-abhängige Infektion in Embryonen (Abbildung 2). Die Dosen injiziert wurden in der Nähe der gezielte Herausforderung Dosen (Tag 0 in Abbildung 2). Nur geringfügige Abweichungen innerhalb von Gruppen beobachtet wurden. Embryonen mit hohen Herausforderung Dosen zeigte Variable Infektion Fortschreiten an 1 Tag und 2 Tage nach der Injektion injiziert (Abbildung 2, 6000 und 2000 KBE). Der S. Aureus -Bakterien entweder ausgerottet wurden oder hatte stark vermehrt und anschließend gegründet hohe Infektion innerhalb der Embryonen injiziert. Dies ist vergleichbar mit den gemeldeten Fortschreiten der S. Aureus -Infektion nach intravenöser Injektion in Zebrafisch-Embryonen-26. Embryonen injiziert mit niedrigen Herausforderung Dosen von S. Aureus gelöscht die Bakterien (Abbildung 2, 600 und 200 KBE). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Herausforderung-Dosis von S. Aureus ihre Infektion Fortschreiten in den Zebrafish Embryos stark beeinflusst.
Co-Injektion von Bakterien und Mikrosphären führte zu höheren Anzahl von Bakterien, die als Injektion von Bakterien nur (Daten nicht gezeigt) injiziert. Durch die Vorbereitung der bakterielle Inokulum für die "Nur-Bakterien" Injektionen mit einer höheren Konzentration (ca. 1,5 Mal höher) als in der Bakterien-Mikrosphären Suspension, konnten wir den Unterschied in der Anzahl der KBE injiziert zu überwinden. Auf diese Weise ist es möglich, Embryonen in der Gegenwart und in der Abwesenheit von PS10 (Tag 0, Abbildung 3) ähnliche Zahlen von Bakterien zuzuführen. Die Zahl der Mikrosphären pro Injektion variiert. Als Beispiel in einem unserer Experimente die Hälfte die Embryonen erhalten 1 bis 2 Mikrosphären pro Injektion (12 von 25 Embryonen in der S. Aureus + PS-10 -Gruppe), erhalten einige 3 bis 4 (8 von 25 Embryonen) und ein paar empfangene 5-7 Mikrosphären (5 von 25 em Embryonen). Solche Variationen die Ebenen der zellulären Antworten provozierten, jedoch keinen Einfluss, wie in einer früheren Studie33berichtet.
Als nächstes untersuchten wir, ob das Vorhandensein von Mikrosphären eine Auswirkung auf das Fortschreiten der Infektion in den Zebrafish Embryos mit niedrigen Dosen von S. Aureusin Frage gestellt hat. Zu diesem Zweck injiziert wir rund 600 KBE S. Aureus- mCherry mit oder ohne PS10. Wir zwei Methoden verwendet, um das Fortschreiten der Infektion zu studieren: (i) die konventionelle quantitativen Kultur der infizierten Embryonen nach Zerkleinerung und (Ii) Bewertung der mikroskopische Nachweis ("mikroskopische scoring") von fluoreszierenden Bakterien (S. Aureus- mCherry). Wir verglichen die Ergebnisse aus beiden Methoden. Die Partitur wurde definiert als "Ja" oder "Nein" Sichtbarkeit von fluoreszierenden Bakterien in die Embryonen, unabhängig von der Fluoreszenzintensität. Unsere Resultate zeigten, dass alle Embryonen mit mehr als 20 KBE von S. Aureus- mCherry im mikroskopischen scoring (rote Punkte in Abbildung 3) positiv waren. Für 600 KBE von S. Aureus pro Embryo schien das Vorhandensein von PS10 nicht das Fortschreiten der Infektion wesentlich beeinflussen. Zum Zeitpunkt Punkte, sowohl die Frequenz des infizierten Embryos (auf Abbildung 3, geringe Herausforderung Dosis angegeben) und die Nummern der KBE nach Niederschlagung unterschieden sich nicht für Embryonen mit oder ohne PS10 (Abbildung 3, geringe Herausforderung Dosis). Dies suggeriert, dass höhere Dosen der Herausforderung von S. Aureus für die potenziellen Auswirkungen der Biomaterialien auf Infektion Fortschreiten in den Zebrafish Embryos erforderlich sind. Daher injiziert wir rund 1.000 KBE von S. Aureus in an- und Abwesenheit von PS10 in Embryonen. Die mikroskopische Bewertung zeigten Unterschiede in der Häufigkeit der infizierten Embryonen mit und ohne PS10 nicht zu jedem Zeitpunkt (Abbildung 3, hohe Herausforderung Dosis). Die quantitativen Kultur, jedoch zeigte höhere KBE Zahlen abgerufen von Embryonen in der S. Aureus + PS-10 -Gruppe als jene aus der S. Aureus -nur Gruppe 2 Tage nach der Injektion (Abbildung 3, hohe abgerufen Herausforderung-Dosis).
Um das Ausmaß der Infektion in der Gegenwart und in der Abwesenheit von Biomaterialien in den Zebrafish Embryos durch die Bildanalyse zu quantifizieren, verzeichneten wir eine Serie von Bildern zeigt das Fortschreiten der Infektion der S. Aureus- mCherry (1.000 KBE pro Embryo) in der Gegenwart und das Fehlen von PS10 in live Embryonen im Laufe der Zeit (Abb. 4A). Das provozierte Eindringen von Kaede grün fluoreszierendes Protein exprimierenden Makrophagen verzeichneten wir auch die Embryonen, die immun-Zell-Antwort (Abbildung 4 b) zu quantifizieren. Kaede fluoreszierenden Proteins kann Farbkonvertierung von Grün auf rot unter Einwirkung von UV-Licht, je nach Belichtungszeit und Intensität des Lichts39unterzogen werden. Diese Farbumwandlung war jedoch nicht unter den experimentellen Bedingungen verwendet in der vorliegenden Studie beobachtet. Der Fluoreszenzintensität der infizierenden Bakterien sowie ab der eindringende Makrophagen innerhalb eines standardisierten Bereichs um die Injektionsstelle herum war gemessen an unserer ObjectJ-Projektdatei "Zebrafisch-Immunotest", im Bild J." Zebrafisch-Immunotest"definiert eine standardisierte Fläche mit einem Durchmesser von 100 µm (gelbe Kreise in Abbildung 4) um einen angegebenen Punkt der Injektion. In die Embryonen enthalten diese Gegend die Mehrheit der fluoreszierenden Bakterien mit Wohnsitz in der Nähe des injizierten Mikrosphären sowie die eindringende Makrophagen. Das Vorhandensein von Biomaterial zeigte sich beide ursprünglichen Anfälligkeit für Infektionen und immun-Zell-Reaktionen zu beeinflussen. Infiltration von Makrophagen als Reaktion auf S. Aureus war 5 h nach der Injektion nur deutlich höher als in Reaktion auf S. Aureus + PS10 (Abbildung 5, Makrophagen Infiltration, 5 Hpi). 1 Tag nach der Injektion Embryonen mit PS10 zeigte signifikant höhere Niveaus von S. Aureus -Infektion als Embryonen ohne PS10 (Abbildung 5, Fortschreiten der Infektion 1 dpi). So, diese quantitative Ergebnisse zeigten, dass die Kombination von Fluoreszenz Bildaufzeichnung und die ObjectJ-Projektdatei "Zebrafisch-Immunotest" verwendet werden, kann um das Fortschreiten der Infektion zu quantifizieren und Immunzelle Reaktion in Anwesenheit von provoziert eine Biomaterial im Zebrafish Embryos Modell. Das Modell ermöglicht kleine Unterschiede in der immun-Zell-Antworten und Ebenen der bakteriellen Infektion in-vivo Beurteilung, und es erfordert nur ein Stereo-Fluoreszenzmikroskop (mit Bildaufnahme) und der Open-Access "Zebrafisch-Immunotest" für die Bewertung.
Abbildung 1: Schematische Vorgehensweise des Co-Injektion der Bakterien-Mikrosphären Suspension in den Schweif Muskel von Zebrafisch-Embryonen. Diese Zahl verändert wurde von Zhang Et Al.33 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Anzahl der KBE von S. Aureus abgerufen von Zebrafisch-Embryonen injiziert mit Inokula, von 6.000 bis hin zu 200 KBE pro Embryo und auf 0 bis 2 Tage nach der Injektion beurteilt. Die roten Linien stellen die mediane Anzahl der KBE. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Anzahl der KBE und mikroskopische Bewertung der mCherry Protein exprimierenden S. Aureus (S. Aureus- mCherry) in den Zebrafish Embryos, zu verschiedenen Zeitpunkten beurteilt. Geringe Herausforderung Dosis: 600 KBE pro Embryo; Hohe Herausforderung Dosis: 1.000 KBE pro Embryo; PS10: 10 µm PS Mikrosphären; "+", Embryonen mit S. Aureus- mCherry zusammen mit PS10injiziert; "-", Embryonen injiziert mit S. Aureus- mCherry nur, also ohne PS10. Embryonen wurden mikroskopisch erzielte für fluoreszierende Bakterien und nach dem Zufallsprinzip ausgewählt für quantitative Kultur von Bakterien nach der Zerkleinerung von Embryonen am Tag der Injektion (Tag 0) und am Tag1 und Tag2 nach der Injektion. Die Embryonen mikroskopisch erzielte Positive und Negative für fluoreszierende Bakterien werden in roten und schwarzen Punkten angezeigt. Die Zahl der mikroskopisch positiv bewerteten Embryonen dividiert durch die Gesamtzahl der Embryonen (Häufigkeit des infizierten Embryonen) zu jedem Zeitpunkt erzielt werden am oberen Rand der Grafik angegeben. Unterschiede in Frequenzen von infizierten Embryonen und Anzahl der KBE der S. Aureus + PS10 und S. Aureus nur Gruppen zu jedem Zeitpunkt analysiert wurden durch den Fisher "exakte Test und Mann-Whitney-Test, beziehungsweise. p ≤ 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder Aufnahme der Infektion Fortschreiten der mCherry exprimierenden S. Aureus (A, rot) in der Anwesenheit und Abwesenheit von 10 µm PS Mikrosphären (PS10, blau) und die provoziert Infiltration Kaede Protein-zum Ausdruck zu bringen Makrophagen (B, grün) bei Embryonen von 5 h nach der Injektion (Hpi), 2 Tage nach der Injektion (dpi). Nicht-behandelten Embryonen (NT) dienten als Kontrollen. Die gelben Kreise (100 µm im Durchmesser) zeigen die standardisierte Bereich an der Injektionsstelle zur Fluoreszenz Quantifizierung mit der ObjectJ-Projektdatei "Zebrafisch-Immunotest". Die quantifizierte Fluoreszenz von Bakterien und von Makrophagen ist in Abbildung 5dargestellt. Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Fluoreszenz Quantifizierung von S. Aureus Infektion Fortschreiten und das provoziert Makrophagen Eindringen in an- und Abwesenheit von 10 µm PS Mikrosphären (PS10) in den Zebrafish Embryos von 5 Stunden nach der Injektion (Hpi) bis 2 Tage nach der Injektion (dpi), mit dem ObjectJ-Projekt-Datei "Zebrafisch-Immunotest". Eine standardisierte Umgebung an der Injektionsstelle diente Fluoreszenz Quantifizierung (mit einem Durchmesser von 100 µm, angegeben als die gelben Kreise in Abbildung 4). Nicht-behandelten Embryonen (NT) dienten als Kontrollen. Unterschiede zwischen jeweils zwei Gruppen jeweils Punkt analysiert wurden, durch die Mann-Whitney-test, *p ≤ 0,05, **p < 0,01 ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Biomaterial-assoziierten Infektionen (BAI) ist eine schwerwiegende klinische Komplikation. Ein besseres Verständnis der Pathogenese der BAI in-vivo böte neue Erkenntnisse zur Verbesserung der Prävention und Behandlung von BAI. Jedoch aktuelle experimentelle BAI Tiermodellen wie murinen Modelle sind teuer, arbeitsintensiv und erfordern spezialisiertes Personal in komplexe chirurgische Techniken geschult. Daher eignen sich diese Modelle nicht für Hochdurchsatz-Analyse. Da Anforderungen Zebrafish Embryos Modelle weniger komplex sind und Kosten im Allgemeinen niedriger als bei murinen Modellen sind, die vorliegende Studie geprüft, ob Zebrafisch-Embryonen als eine neuartige vertebrate Tiermodell verwendet werden können, für die Untersuchung von BAI in-vivo, ergänzend zu die Säugetier-Modelle.
Um das Zebrafish Embryos BAI Modell einzurichten, entwickelten wir ein Protokoll des Co-Injektion von Bakterien und Mikrosphären basierend auf eine Methode für die intramuskuläre Injektion von Mikrosphären in Embryonen vor33beschrieben. Auf diese Weise sind die meisten Bakterien in der Nähe der Mikrosphären in Embryonen, imitiert die Bakterien-Biomaterial-Interaktion, die während oder kurz nach der Implantation von Biomaterialien bei Menschen/Säugetieren stattfindet.
Um den Verlauf der Infektion in der Gegenwart und in der Abwesenheit von Mikrosphären in den Zebrafish Embryos vergleichen zu können, sollten Embryonen mit ähnlichen anfänglichen Zahlen von Bakterien mit und ohne Mikrosphären angefochten werden. Unserer Erfahrung nach Co-Injektion von Bakterien-Mikrosphären Aufhängung ergibt mehr Bakterien als Injektion "Bakterien-only" Suspension injiziert werden. Um dieses Problem zu beheben, sollte das Verhältnis zwischen der Konzentration von Bakterien im "Nur-Bakterien" Suspensionen (ohne Mikrosphären) und in Bakterien-Mikrosphären Suspensionen zugeschnitten sein. In der vorliegenden Studie, die Konzentration von S. Aureus in der "Nur-Bakterien" Suspension etwa 1,5 Mal höher als die Konzentration in der Bakterien-Mikrosphären Suspension werden musste. Ob dieses Verhältnis gilt auch für andere Bakterienarten und andere Biomaterialien bleibt getestet werden. Der Hinweis auf ähnliche Zahlen von Bakterien mit und ohne Mikrosphären, injizieren sollte die Öffnung der Nadeln Injektionen entweder Suspension verwendet möglichst identisch wie möglich sein.
Einige Eigenschaften von Biomaterial wie Form und Größe spielen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Injectability und Co-Injektion mit Bakterien. In der vorliegenden Studie, haben wir 10 µm-Mikrokügelchen aus Polystyrol (PS10) als Modell Biomaterialien. Unserer Erfahrung nach sind Mikrosphären von einer Größe von bis zu 15 µm injizierbaren für 3 Tage alten Embryonen nach dem Protokoll in der vorliegenden Studie33entwickelt. Für Mikrosphären eine relativ große Größe (z. B., ≥ 10 µm), die Verwendung von nicht-Prozess zu entmutigen oder unregelmäßig geformte Mikrosphären/Mikropartikel, die tendenziell dazu führen, dass der Nadel verstopfen. Wenn Biomaterialien in anderen Formen als Runde und in verschiedenen Größen gewählt werden, verwendet werden, muss ihre Injectability getestet werden. Für die (mit-) Injektion von Mikrosphären und Bakterien haben wir eine 4 % ige Polyvinylpyrrolidon (PVP) Lösung um Dispersion zu erleichtern. Dies kann in der Regel für die Injektion von Biomaterialien mit und ohne Bakterien in Embryonen hilfreich sein.
Da war der Fall für Injektionen von Mikrosphären nur33,40, variiert die Anzahl der Mikrosphären zusammen mit Bakterien in Embryonen injiziert pro Injektion, meist zwischen 1 bis 4 Mikrosphären pro Embryo. Jedoch da diese Variationen nicht zu Unterschiede in der Reaktion provoziert Immunzelle Embryonen33geführt hat, wurden sie auch nicht erwartet, die potenziellen Auswirkungen der Mikrosphären auf Infektion Fortschreiten zu beeinflussen. Dennoch würden neuartige Ansätze ermöglicht Injektionen von einem einzelnen Mikrosphären (allein oder zusammen mit Bakterien) übrig.
Wir beurteilen ob mikroskopische Bewertung der Anwesenheit von fluoreszierenden Bakterien als ein "Ja"oder "Nein" scoring-System, um Infektion Fortschreiten in live Embryonen zu analysieren verwendet werden kann. Das Kriterium einer positiven mikroskopischen Partitur wurde definiert als das Vorhandensein von sichtbaren fluoreszierenden Bakterien, unabhängig von der Fluoreszenzintensität. Im Vergleich zu quantitativen Kultur von Bakterien, schlug unsere repräsentative Ergebnisse, dass mikroskopische scoring Embryonen mit 20 oder mehr KBE von S. Aureus -Bakterien von Embryonen mit einer geringeren Anzahl von KBE oder keine Infektion unterscheiden kann. So, da nur eine geringe Anzahl von Bakterien für eine positive Bewertung erforderlich sind, ist diese Methode fast so empfindlich wie quantitativen Kultur. Da die Embryonen nicht geopfert werden müssen und keine High-End Mikroskope oder Sortieranlagen für Fluoreszenz erforderlich sind, um mit dieser Methode Analysen durchzuführen, halten wir mikroskopische erzielte eine einfache, aber zuverlässige Methode, um das Fortschreiten der Infektion der überwachen Bakterien in live Embryonen. Für Quantitative Analyse des Niveaus der Infektion (eher als die "Ja" oder "Nein" scoring-System wie beschrieben oben) und immun-Zell-Antwort in einzelne live Embryonen angewendet wir die ObjectJ-Projektdatei "Zebrafisch-Immunotest" Fluoreszenzintensität der Quantifizierung die fluoreszierenden Bakterien und fluoreszierende Makrophagen aufgenommen im Laufe der Zeit. Wir verwendeten eine standardisierte Umgebung (mit einem Durchmesser von 100 m) rund um die Einstichstelle um Fluoreszenz, zu messen, da dieser Bereich gezeigt wurde, um einen Großteil der Bakterien und die eindringende Makrophagen enthalten. Ein ausführliches Handbuch "Zebrafisch-Immunotest" erschien bisher33,40. Der Hinweis ist "Zebrafisch-Immunotest" eine open-Access-Plug-in für ImageJ, die vom Benutzer zugeschnitten werden können. Zum Beispiel kann der Durchmesser der Bereich der Analyse und andere Parameter von "Zebrafisch-Immunotest" frei geändert werden nach der Studie-Setup (siehe Beispiele in den Link in Schritt 7 des Protokolls zur Verfügung gestellt).
Um die möglichen Infektion steigernden Auswirkungen von Biomaterialien in den Zebrafish Embryos zeigen, muss die Herausforderung-Dosis von Bakterien beurteilt werden. In der vorliegenden Studie fanden wir, dass eine Herausforderung-Dosis von 1.000 KBE von S. Aureus pro Embryo oder höher erforderlich ist. Höhere Ebenen der S. Aureus -Infektion bei Embryonen mit PS10 als in denen ohne PS10 fanden sich an den ersten 2 Tagen nach der Injektion, darauf hinweist, dass das Vorhandensein von Biomaterialien vorübergehend Auswuchs von S. Aureus erleichtert in der Embryonen. Ob Infektion auf hohem Niveau in Anwesenheit von Biomaterialien zu späteren Zeitpunkten bleibt sollten ältere Embryonen unter ethischen Zulassung gemäß geltenden Vorschriften untersucht werden. Da die Clearance von S. Aureus in den Zebrafish Embryos vor allem Phagozytose und Tötung von Makrophagen und Neutrophilen23,24abhängt, könnte Auswuchs von Bakterien durch eine verringerte Wirksamkeit von erklärt werden die Phagozyten zur Abtötung von Bakterien durch die Anwesenheit von Biomaterialien. Dies ist im Einklang mit den bekannten Infektionsrisiko Verbesserung von Biomaterialien in Patienten2,4,15, häufig auch in komplexeren Tiermodellen wie Maus und anderen Tiermodellen10 beobachtet ,11,12,13. Neben der S. Aureus -Infektion kann Infektion Fortschreiten von S. Epidermidis oder andere Krankheitserreger im Beisein von Biomaterialien untersucht werden nach dem in der vorliegenden Studie beschriebenen Protokoll. Unter dem Gesichtspunkt der Biomaterialien beeinflussen verschiedene Materialeigenschaften (z.B., , chemische Zusammensetzung, Hydrophobie, Rauheit und Oberfläche Gebühren) der zellulären Reaktionen und/oder Bakterien-Material Interaktion41, 42. unserer vorherigen Studie hat gezeigt, dass die Injektion von Biomaterial (in Anwesenheit von PVP) eine stärkere Makrophagen Infiltration im Vergleich zur Injektion von nur PVP in den Zebrafish Embryos provoziert. Darüber hinaus Zebrafisch-Embryonen reagiert anders auf Mikrosphären gemacht von Poly (-Caprolacton) und Polystyrol33. Daher müssen Injektion von Mikrosphären unterschiedlicher Natur auch unterschiedliche Auswirkungen auf die Verbesserung der Infektion, die relativ leicht durch das hier beschriebene Verfahren bewertet werden können.
Für die weitere Entwicklung kann dieses Zebrafish Embryos BAI Modell geändert werden, für einen hohen Durchsatz System mit Roboter-Injektion27,43, parametrische Analyse von komplexen Objekten und Sortieranlagen (COPAS) und hohem Durchsatz, automatisierte RNA-Sequenz-Analyse27,44. Solcher Zebrafish Embryos basierende Hochdurchsatz BAI Modelle können als ganze Tier Systeme für in Vivo screening und Tests von Anti-infektive Biomaterialien (Roman) sowie die Prüfung der Wirksamkeit der Behandlung mit Antibiotika oder andere Anti-BAI-Strategien verwendet werden. Darüber hinaus ist das intrazelluläre überleben eine wichtige Strategie von Bakterien zum Überleben im Beisein von Biomaterialien9,10,11,12,13. Die Nützlichkeit von Zebrafisch-Embryonen für das Studium intrazelluläre Infektion hat sich in mehreren Studien36,46gezeigt. So kann unser Embryo-Muster verwendet werden, um das intrazelluläre Überleben der Staphylokokken oder andere intrazelluläre Krankheitserreger im Beisein von Biomaterialien und Strategien zur Behandlung von solchen intrazellulären Infektionen zu studieren. Darüber hinaus kann in-situ Hybridisierung Techniken45 im Modell verwendet werden, untersuchen den Einfluss von Bakterien oder Biomaterialien oder deren Kombination auf die Expression bestimmter Gene an der Injektionsstelle, die möglicherweise hilfreich für Markergene für entdecken BAI.
Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie das Potenzial von Zebrafisch-Embryonen mit den Methoden entwickelt hier um Biomaterial-assoziierten Infektion in Echtzeit in vivo zu untersuchen. Dieses Modell Zebrafish Embryos kann daher neuartige Infektion beständig Biomaterialien und vielversprechende Prävention und Behandlungsstrategien von BAI untersuchen, und schließen Sie die Lücke zwischen in-vitro-Studien und größeren Tiermodelle verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde finanziell unterstützt durch das IBIZA-Projekt des Programms biomedizinischen Material (BMM) und mitfinanziert vom niederländischen Ministerium für Wirtschaft und Währung. Die Autoren möchten Prof. Dr. Graham Lieschke Monash University in Australien danken für die Bereitstellung der Zebrafisch transgenen Linie (Mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2 mL pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri dish | Falcon | 353003 | |
| Petri dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
References
- Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
- Otto, M. Staphylococcus epidermidis - the 'accidental' pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
- Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
- Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
- Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
- Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
- Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
- Darouiche, R. O. Current concepts - Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
- Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
- Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. , Springer. New York, NY, USA. 307-354 (2013).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
- Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
- van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
- Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
- Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
- Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
- Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
- Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -V. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. , Oxford University press. Oxford, UK. 7-37 (2002).
- Chaplin, W. T. P. Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , Queen's University. Master thesis (2017).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
- Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
- Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
- Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
- Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).
