Summary
Föreliggande studie beskriver en zebrafiskar embryo modell för Invivo visualisering och intravital analys av biomaterial-associerad infektion över tid baserat på fluorescensmikroskopi. Denna modell är ett lovande system kompletterar däggdjur djurmodeller såsom musmodeller för att studera biomaterial-infektioner i vivo.
Abstract
Biomaterial-associerad infektion (BAI) är en viktig orsak till felet av biomaterial/medicintekniska produkter. Staphylococcus aureus är en av de stora patogenerna i BAI. Aktuella experimentella BAI däggdjur djur modeller såsom musmodeller är kostsamma och tidskrävande och därför inte lämplig för hög genomströmning analys. Således önskas nya djurmodeller som kompletterande system för att undersöka BAI invivo. I denna studie, vi syftar till att utveckla en zebrafiskar embryo modell för Invivo visualisering och intravital analys av bakteriell infektion i närvaro av biomaterial baserat på fluorescensmikroskopi. Dessutom studerades provocerade makrofag svaret. I detta syfte vi använt fluorescerande protein-uttryckande S. aureus och transgena zebrafiskar embryon uttrycker fluorescerande proteiner i deras makrofager och utvecklat ett förfarande för att injicera bakterier ensam eller tillsammans med mikrosfärer i muskeln vävnad av embryon. För att övervaka bakterieinfektion progression i levande embryon över tiden, utarbetade vi en enkel men pålitlig metod av mikroskopiska poängsättning av fluorescerande bakterier. Resultaten från mikroskopiska scoring visade att alla embryon med mer än 20 kolonibildande enheter (CFU) av bakterier gav en positiv fluorescerande signal av bakterier. För att studera de potentiella effekterna av biomaterial på infektion, beslutsamt vi CFU numrerar av S. aureus med och utan 10 µm polystyren mikrosfärer (PS10) som modell biomaterial i embryon. Dessutom använde vi ObjectJ projektfilen ”zebrafisk-Immunotest” i ImageJ för att kvantifiera fluorescensintensiteten hos S. aureus infektion med och utan PS10 över tid. Resultaten från båda metoderna visade högre numrerar av S. aureus i infekterade embryon med mikrosfärer än i embryon utan mikrosfärer, som visar en ökande infektion mottaglighet i närvaro av biomaterial. Den aktuella studien visar således potentialen hos zebrafiskar embryo modellen att studera BAI med de metoder som utvecklats här.
Introduction
En mängd medicinska enheter (kallad ”biomaterial”) används alltmer inom den moderna medicinen att återställa eller ersätta mänskliga kroppen delar1. Dock predisposes implantation av biomaterial en patient infektion, kallas en biomaterial-associerad infektion (BAI), vilket är en betydande komplikation av implantat i kirurgi. Staphylococcus aureus och Staphylococcus epidermidis är två vanligaste bakteriearter som ansvarig för BAI2,3,4,5,6. Implanteras biomaterial bildar en yta som är mottagliga för bakteriell biofilm bildning. Dessutom kan lokala immunsvaret vara rubbad av de implanterade biomaterial, orsakar minskad effektivitet av bakteriell clearance. Initial clearance av infekterar bakterier utförs främst genom att infiltrera neutrofiler, som har starkt minskad bakteriedödande kapacitet i närvaro av en insatt eller implanteras biomaterial7. Dessutom döda makrofager infiltrerar vävnaden efter den inledande tillströmningen av neutrofiler kommer phagocytose de kvarvarande bakterierna men inte effektivt dem intracellulärt, på grund av rubbad immun signalering som är en följd av den kombinerade förekomsten av biomaterial och bakterier8. Således, förekomsten av biomaterial kan underlätta intracellulär överlevnad av bakterier9,10,11,12,13 och biofilm bildas på den implanterade biomaterial4,14. Följaktligen, BAI kan leda till fel och behöva för byte av implanterade biomaterial, orsakar ökad sjuklighet och dödlighet och förlängd sjukhusvistelse med ytterligare kostnader2,15.
Ett ökande antal anti-BAI strategier håller utvecklade2,16,17. In vivo utvärdering av effekten av dessa strategier i relevanta djurmodeller är nödvändig. Traditionella experimentella BAI djurmodeller (t.ex., musmodeller) är dock oftast dyrt, tidskrävande och därför inte lämplig för hög genomströmning tester av flera strategier18. Senaste utvecklingen av bio-optiska bildteknik baserat på självlysande/fluorescerande märkning av värdceller och bakterier kan möjliggöra kontinuerlig övervakning av BAI progression och värd-patogen/värd-material interaktioner i enstaka små djur såsom möss18,19,20,21. Men denna teknik är relativt komplexa och fortfarande i sin linda och flera problem måste åtgärdas för kvantitativ analys av BAI18. Exempelvis krävs en hög utmaning dos att visualisera bakteriell kolonisation. Dessutom ljus spridning och adsorption av Mareld/fluorescens signaler i vävnader hos däggdjur test djur måste också åtgärdas18,19,21. Roman, kostnadseffektiv djurmodeller som möjliggör intravital visualisering och kvantitativ analys över tid är därför värdefull kompletterande system för att studera BAI invivo.
Sebrafisken (embryon) har använts som ett mångsidigt invivo verktyg för dissekera värd-patogen interaktioner och infektion patogenesen av flera bakteriearter som mykobakterier22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25och stafylokocker26,27. Zebrafiskar embryon har många fördelar såsom optisk transparens, relativt låga underhållskostnader och innehav av ett immunsystem som är mycket lik den i däggdjur28,29. Detta gör zebrafiskar embryon mycket ekonomiska, levande modellorganism för intravital visualisering och analys av infektion progression och associerade värd Svaren28,29. Att tillåta visualisering av cell beteende i vivo, transgena zebrafiskar linjer med olika typer av immunceller (t.ex., makrofager och neutrofiler) och även med fluorescently märkta subcellulära strukturer har utvecklat28 ,29. Dessutom, ger hög reproduktion andelen zebrafiskar möjligheten att utveckla hög genomströmning testsystem med automatisk robotic injektion, automatiserade fluorescens kvantifiering och RNA-sekvens analys27, 30.
I den aktuella studien, syftar vi till att utveckla en zebrafiskar embryo modell för biomaterial-associerad infektion med hjälp av fluorescens avbildningstekniker. För detta ändamål har vi utvecklat ett förfarande för att injicera bakterier (S. aureus) i närvaro av biomaterial mikrosfärer in i muskelvävnaden zebrafiskar embryon. Vi använde S. aureus RN4220 uttrycker mCherry fluorescerande protein (S. aureus- mCherry), som konstruerades enligt någon annanstans för en annan S. aureus -stam10,31. Transgena zebrafiskar linjen (mpeg1: UAS/Kaede) uttrycker Kaede grönt fluorescerande protein i makrofager32 och blå fluorescerande polystyren mikrosfärerna användes. I en tidigare studie har vi visat att intramuskulär injektion av mikrosfärer i zebrafiskar embryon att efterlikna biomaterial implantation är genomförbart33. För att kvantitativt analysera utvecklingen av BAI och associerade cell infiltration i enda embryon över tiden, använde vi filen ”zebrafisk-Immunotest”-projekt som drivs inom ”ObjectJ” (en plug-in för ImageJ) att kvantifiera fluorescensintensiteten hos bakterier som är bosatta och makrofager infiltrerar i närheten av injektionsstället mikrosfärer33. Dessutom vi bestäms antalet kolonibildande enheter (CFU) av bakterier i närvaro och frånvaro av mikrosfärer i embryon att studera potentiella effekter av biomaterial på infektion. Våra aktuella studien visar att zebrafiskar embryot med de metoder som utvecklats här, är en lovande, roman ryggradsdjur djurmodell för att studera biomaterial-infektioner i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I detta protokoll är underhåll av vuxen zebrafiskar i överensstämmelse med de lokala djurskyddsbestämmelserna som godkänts av utskottet för lokala djurens välbefinnande. Experiment med embryon utfördes enligt direktiv 2010/63/EU.
1. beredning ”endast bakterier” och bakterier-mikrosfärer suspensioner
Obs: S. aureus RN4220 stammen uttrycker mCherry fluorescerande protein (S. aureus- mCherry) används. S. aureus RN4220 stam är muterad i virulens regulator gen agrA (tillbehör gen regulator A)34, och därför kanske relativt låg virulens i zebrafiskar embryo modellen. Andra stammar av S. aureus eller andra bakteriearter för BAI kan användas.
-
Ta 4 till 5 kolonier av S. aureus RN4220 bakterier från tryptic soja agarplattor kompletteras med 10 µg/mL kloramfenikol i kultur och kultur bakterierna till mitten av-logaritmisk tillväxtfas i 10 mL tryptic soy buljong kompletteras med 10 µg/mL kloramfenikol vid 37 ° C under skakning.
- Under kultur, späd 100 µL av bakteriesuspensionen i 900 µL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en kyvetten (bredd av 1 cm) för en optisk densitet (OD) mätning på 620 nm (OD620). Kultur bakterierna tills OD620 når 0,4 – 0,8.
Obs: En OD620 av 0.1 allmänt motsvarar 3,0 x 107 CFU/mL S. aureus. OD620 av ett inokulum av bakterier i mitten av logaritmisk tillväxtfas är mellan 0,4-0,8. Olika tidsperioder för odling kan behövas för andra arter och stammar av bakterier.
- Under kultur, späd 100 µL av bakteriesuspensionen i 900 µL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en kyvetten (bredd av 1 cm) för en optisk densitet (OD) mätning på 620 nm (OD620). Kultur bakterierna tills OD620 når 0,4 – 0,8.
- Centrifugera bakterier vid 3 500 x g i 10 min och resuspendera pelleterat bakterierna i 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Därefter tvätta bakterierna med steril PBS 2 gånger och slutligen återsuspendering bakterierna i 1,1 mL 4% (w/v) polyvinylpyrrolidon40 (PVP40) lösning i PBS.
- Vortex denna bakteriesuspension och utspädd 100 µL suspensionen i 900 µL sterilt PBS i en kyvetten för OD620 mätning. Justera koncentrationen av bakteriesuspensionen med PVP40 lösning. Detta är den ”bakterier-bara” suspensionen.
- Biomaterial kan väljas fritt att blanda med bakteriesuspensionen. I den aktuella studien, som kommersiella polystyren (PS) mikrosfärer (blå fluorescerande, 10 µm) används. Generera en bakterier-mikrosfärer suspension, Centrifugera mikrosfärerna för 1 min på 1 000 x g, rumstemperatur, avlägsna supernatanten och slamma mikrosfärerna i ”bakterier-bara” avstängning (i PVP40 lösning).
- För att injicera ungefär lika doser av bakterier i närvaro och i frånvaro av mikrosfärer, behöver koncentrationen av bakterier-mikrosfärer suspension vara två tredjedelar av koncentrationen av den ”bakterier-bara” suspensionen (utan mikrosfärer). Detta uppnås genom att späda ut bakterier-mikrosfärer fjädringen med 0,5 volym PVP40 lösning. Blanda upphävanden av vortexa. Notera har detta förhållande (två tredjedelar) utvärderats för S. aureus. Det är också lämpligt för S. epidermidis, men det är klokt att kontrollera om detta förhållande även gäller andra bakteriearter och andra storlekar (än 10 µm) eller former av biomaterial (än mikrosfärer) som skall injiceras.
- Kontrollera koncentrationen av ”endast bakterier” och bakterier-mikrosfärer suspensionen av kvantitativa kultur 10-faldig seriella utspädningar enligt nedan: överföring 100 µL av upphängningarna till en 96 väl-plattan och seriellt utspädd genom att överföra 10 µL portioner av den upphängning till 90 µL sterilt PBS. Plåt duplicerad 10 µL portioner av den outspädda och utspädda suspensioner på Agarosplattorna, inkubera plattorna vid 37 ° C över natten, räkna kolonierna och beräkna antalet bakterier (kolonibildande enheter. CFU).
2. avel, skörd och underhåll av zebrafisk embryon
- Följ de allmänna procedurer beskrivs tidigare35,36 för avel, skörd och underhåll av zebrafisk embryon, med ändringar som beskrivs nedan. Korsa en familj av vildtyp Tupfel lång fin (TL) zebrafiskar eller Sebrafisken för den valda transgena raden (här, Mpeg1: Kaede) i en tank med netto lagt till att framkalla de vuxna kvinnlina att producera ägg efter ljuset tänds, sedan separera vuxna från producerade ägg.
- Samla embryona nästa dag och kasta icke-transparenta de som inte är livskraftiga. Håller cirka 60 embryon per petriskål (100 mm i diameter) i E3 medium37 och inkubera vid 28 ° C. Ta bort döda och onormala embryon och uppdatera E3 medium dagligen.
3. beredning av injektionsnålar
- Förbereda glas microcapillary nålar för injektion med hjälp av en mikropipett avdragare instrument. Använd följande inställningar: värme: 772, pull: 100, vel: 200, tid: 40, gas: 75.
- Bryta nålspetsen med pincett vid den plats där nålen har en yttre diameter av ungefärligt 20 µm (för 10 µm mikrosfärer), med ett ljusmikroskop med en skalstapeln i okulära. Undvika nålar med en mycket stor öppning storlek, eftersom de kommer att äventyra överlevnaden av embryon.
Obs: Öppningen kan vara valt att vara mindre eller större, beroende på storleken och formen av biomaterial som skall injiceras. I litteraturen, har injektioner med nålar med en öppning av ungefärligt 50 µm rapporterats orsaka en betydande minskning av embryo överlevnad38.
4. injektion av ”bakterier-Only” eller bakterier-mikrosfärer Suspension i zebrafiskar embryon
- Hetta upp agaros lösning (1-1,5% (wt) i demi-vatten) med en mikrovågsugn och häll i en 100 mm petriskål. Placera en plast mögel ovanpå agaros lösningen i petriskål att skapa indrag i Agarens för att placera embryon i rätt positioner, att underlätta injektioner. Odla i rumstemperatur och ta bort mögel när lösningen agarosen stelnat.
- På 3 d efter befruktning, placera embryon i en 100 mm petriskål som innehåller 0,02% (w/v) 3-aminobensoesyra syra (Tricaine) för att bedöva dem. Efter 5 min, överföra embryon till agaros plattan överdrog med E3 medium som innehåller 0,02% (w/v) Tricaine och justera dem i en orientering för injektion. För Mpeg1: Kaede transgena linje först bedöva embryon i E3 medium som innehåller 0,02% (w/v) tricaine. Välj sedan embryon uttrycker grön fluorescerande proteiner med stereo fluorescens Mikroskop.
-
Fyll nålen med ca 10 µL av den ”endast bakterier” eller bakterier-mikrosfärer suspensionen med hjälp av en microloader pipettspetsen. Montera på injektionsnålen på en micromanipulator ansluten till mikro-injektorn. För injektorn används här (se tabell för material), använda följande inställningar för injektioner av 2 – 3 nL: Tryck: 300 – 350, mottryck: 0, tid: 2 ms.
Obs: Inställningarna för mikro-injektorn beror på injektorn används. Injektor inställningar kan behöva justeras för injektioner av bakterier blandat med biomaterial med andra former och storlekar.- Använd nålar med samma öppningen för injektion av ”bakterier-bara” fjädringen och bakterier-mikrosfärer upphängning. Om nålen är trasig eller igensatt, ändra alltid en ny nål för ytterligare injektioner.
- Stick in nålen i muskelvävnaden embryon under ett ljusmikroskop (figur 1), i en vinkel på 45 – 60 ° mellan nålen och kroppen av embryon. Justera positionen av nålen i vävnaden genom att försiktigt flytta den fram och tillbaka. Injicera embryon med en fotpedal ansluten till mikro-injektorn.
- Efter injektion av fluorescerande bakterier, Poäng embryon för framgångsrik infektion i stereo fluorescens Mikroskop. Kassera de embryon gjorde negativa (inga synliga fluorescerande bakterier eller inga synliga fluorescerande mikrosfärer). Upprätthålla embryon individuellt i E3 medium i 48 brunnar. Uppdatera mediet dagligen.
5. krossning av embryon, mikroskopiska Scoring och kvantitativa kultur av bakterier
- Poäng alla embryon mikroskopiskt för förekomst av fluorescerande bakterier med stereo fluorescens Mikroskop, börjar omedelbart efter injektionerna, och på varje efterföljande dag tills embryon väljs slumpmässigt för kvantitativa kultur.
- Slumpmässigt välja några levande infekterade embryon (5 till 6 i den aktuella studien) kort efter injektion och överföra dem individuellt till separat 2 mL mikrorör med steril tips. Ta bort mediet, tvätta embryona försiktigt med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning en gång och tillsätt 100 µL sterilt PBS.
- Lägg 2 – 3 sterila zirkonia pärlor (2 mm i diameter) till en injektionsflaska och krossa de embryon som använder homogenisatorn (se Tabell för material) vid 3500 rpm för 30 s. kultur Homogenatet kvantitativt som beskrivs i steg 1.3.
Obs: Andra Homogenisatorer kan kräva olika inställningar. - Välj slumpmässigt flera embryon på efterföljande dagar efter injektion för kvantitativa kultur enligt steg 5.3.
6. fluorescensmikroskopi av infektion Progression och provocerade Cell Infiltration i zebrafiskar embryon
- Bedöva embryon som beskrivs i steg 4,2. Pipettera 500 µL av en PBS - 2% (wt) metyl cellulosa lösning i en petriskål innehållande E3 medium med 0,02% (w/v) Tricaine. Placera embryona i metyl cellulosa lösning och hålla dem raka och horisontella.
Obs: Metyl cellulosa lösning används som ett ”klister”, som på grund av dess viskositet, kan tillfälligt immobilisera embryon i bästa orientering för avbildning. - Använda ett stereo fluorescens Mikroskop utrustat med ljusa fält, mCherry, grönt fluorescerande protein (GFP) och UV filter bild enskilda embryon under identiska optimerade inställningar (t.ex., intensitet, vinst och exponering tid) på 160 x förstoring . Ange fokalplanet så att vävnadsskador som orsakats av injektionen är i fokus, med hjälp av ljusa fältfilter. Ange Z-stacken djup på 10 µm och steg storlek på 5 µm, som möjliggör inspelning av 3 på varandra följande bilder.
- Bild enskilda embryon en gång dagligen från 5 h efter injektion tills 2 dagar efter injektion. Utesluta döda embryon (inga hjärtslag eller embryo delvis förstörd) för ytterligare imaging och analys. Upprätthålla embryon individuellt i E3 medium i 48 brunnar. Uppdatera mediet dagligen.
7. kvantitativ analys av fluorescensintensiteten hos infektion Progression och provocerade Cell Infiltration använder objektet J projektfil ”zebrafisk-Immunotest”
- Ladda ner ”zebrafisk-Immunotest” och den detaljerade handboken från länken: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, som beskrivs i en tidigare studie33. I korthet, öppna bilder för analys med ”zebrafisk-Immunotest”, verkar under gratisprogrammet Image J. I varje inläst bild, manuellt markera injektionsstället baserat på observerade vävnadsskadan av embryon.
Obs: Markerade platsen används av ”zebrafisk-Immunotest” som mittpunkten för att upptäcka fluorescens toppen inom ett avstånd av 50 µm. Upptäckta fluorescens toppen används sedan som centrum i ett standardiserat område (diameter 100 µm) för fluorescens mätningar. - Klicka på ”beräkning” i menyn objekt J att köra fluorescerande mätning för flera kanaler, om tillämpligt, automatiskt för alla bilder. Exportera data och analysera med lämpliga statistiska metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den föreliggande studien bedömde tillämpligheten av zebrafisk embryon som romanen vertebrate djur modell för att utreda biomaterial-associerad infektion. Mikroskop teknik har vanligen använts att injicera zebrafiskar embryon att orsaka infektion22,26,27,30,36olika bakteriearter. Med hjälp av proceduren som avbildas i figur 1, var S. aureus ensam eller tillsammans med 10 µm PS mikrosfärer (PS10) injiceras in i muskelvävnaden zebrafiskar embryon i den aktuella studien. Intramuskulär injektion av S. aureus orsakade dosberoende infektion i embryon (figur 2). De doser injiceras var nära de riktade utmaning doserna (dag 0 i figur 2). Endast mindre variationer inom grupperna observerades. Embryon som injiceras med hög utmaning doser visade varierande infektion progression på 1 dag och 2 dagar efter injektion (figur 2, 6000 och 2000 CFU). Den injiceras S. aureus bakterier antingen var utrotad eller hade frodats och därefter etablerade höga nivåer av infektion inom embryon. Detta liknar rapporterade progressionen av S. aureus infektion efter intravenös injektion i zebrafiskar embryon26. Embryon som injiceras med låg utmaningen doser av S. aureus rensas bakterierna (figur 2, 600 och 200 CFU). Dessa resultat visade att den utmaning dosen av S. aureus starkt påverkar deras infektion progression i zebrafiskar embryon.
Samtidig injektion av bakterier och mikrosfärer resulterade i higher numrerar av bakterier som injicerats än injektion av bakterier bara (inga data anges). Genom att förbereda det bakteriella inokulatet för ”bakterier” endast injektioner vid en högre koncentration (cirka 1,5 gånger högre) än i bakterier-mikrosfärer avstängning, vi kunde övervinna skillnaden i antalet CFU injiceras. Detta sätt, det är möjligt att injicera liknande antal bakterier i embryon i närvaro och i frånvaro av PS10 (dag 0, figur 3). Numrerar av mikrosfärer per injektion varierade. Som ett exempel fick i en av våra experiment, hälften av embryon mottagna 1 till 2 mikrosfärerna per injektion (12 av 25 embryon i PS10 gruppen + S. aureus ), några 3 till 4 (8 av 25 embryon) och några fick 5 till 7 mikrosfärer (5 av 25 em bryos). Sådana variationer påverkade dock inte nivåerna av de provocerade cellulära svar, som rapporterats i en tidigare studie33.
Nästa, vi undersökte huruvida förekomsten av mikrosfärer inverkar på infektion progression i zebrafiskar embryon utmanas med låga doser av S. aureus. I detta syfte injiceras vi cirka 600 CFU av S. aureus- mCherry med eller utan PS10. Vi använde två metoder för att studera infektion progression: a konventionella kvantitativa kultur av infekterade embryon efter krossning, och (ii) poängsättning av mikroskopisk detektion (”mikroskopiska scoring”) av fluorescerande bakterier (S. aureus- mCherry). Vi jämförde resultaten från dessa två metoder. Poäng definierades som ”ja eller nej” synlighet av fluorescerande bakterier i embryon, oavsett fluorescensintensiteten. Våra resultat visade att alla embryon med mer än 20 CFU av S. aureus- mCherry var positiva i mikroskopiska scoring (röda prickar i figur 3). För 600 CFU av S. aureus per embryo tycktes förekomsten av PS10 inte påverka infektion progression. På hela tiden poäng, både frekvensen av infekterad embryon (indikeras ovanpå figur 3, låg utmaningen dos) och antalet CFU efter krossning skilde sig inte för embryon med eller utan PS10 (figur 3, låg utmaningen dos). Detta tyder på att högre utmaning doser av S. aureus krävs för att studera de potentiella effekterna av biomaterial på infektion progression i zebrafiskar embryon. Därför injiceras vi cirka 1000 CFU av S. aureus i närvaro och frånvaro av PS10 i embryon. Mikroskopiska scoring visade inte skillnader i frekvensen av de infektera embryona med och utan PS10 oavsett tidpunkt (figur 3, hög utmaning dos). Den kvantitativa kulturen, dock visade högre CFU nummer Hämtad från embryon i PS10 gruppen än de Hämtad från S. aureus -enda gruppen på 2 dagar efter injektion (figur 3, hög + S. aureus utmaning dos).
För att kvantifiera omfattningen av infektion i närvaro och i frånvaro av biomaterial med zebrafiskar embryon av bildanalys, spelade vi en serie bilder som visar infektion progressionen av S. aureus- mCherry (1000 CFU per embryo) i närvaro och avsaknad av PS10 i levande embryon över tiden (figur 4A). Vi spelade också provocerade infiltrationen av Kaede grönt fluorescerande protein-uttryckande makrofager i embryon att kvantifiera immunceller svaret (figur 4B). Kaede fluorescerande protein kan genomgå färgkonvertering från grönt till rött under exponering för UV-ljus, beroende på exponeringstid och ljusintensitet39. Sådan färgkonvertering observerades dock inte på experimentella villkor som används i den aktuella studien. Fluorescensintensiteten hos infekterande bakterier samt per infiltrating makrofager inom ett standardiserat område runt injektionsstället mättes genom vår ObjectJ projektfil ”zebrafisk-Immunotest”, verksamma inom bild J. ” Zebrafisk-Immunotest ”definierar ett standardiserat område med en diameter på 100 µm (gula cirklar i figur 4) runt en angiven punkt i injektion. Detta område ingår i embryon, majoriteten av fluorescerande bakterier som bor i närheten av den injicerade mikrosfärer, liksom den infiltrating makrofager. Förekomsten av ett biomaterial visades att påverka båda inledande mottaglighet för infektion och immunförsvaret cell svaren. På 5 h efter injektion var makrofag infiltration svar på S. aureus bara betydligt högre än svar på S. aureus + PS10 (figur 5, makrofag infiltration, 5 hpi). 1 dag efter injektion embryon med PS10 visade signifikant högre nivåer av S. aureus infektion än embryon utan PS10 (figur 5, infektion progression, 1 dpi). Således dessa kvantitativa resultat visat att kombinationen av fluorescens bildinspelning och ObjectJ projektfilen ”zebrafisk-Immunotest” kan användas för att kvantifiera infektion progression och provocerade immunceller svar i närvaro av en biomaterial i zebrafiskar embryo modellen. Modellen möjliggör bedömning av små skillnader i immunceller svaren och nivåer av bakteriell infektion i vivo, och det kräver bara en stereo fluorescens Mikroskop (med bildinspelning) och den öppna ”zebrafisk-Immunotest” för utvärdering.
Figur 1: Schematisk tillvägagångssättet av samtidig injektion av bakterier-mikrosfärer suspension i svansen av zebrafisk embryon. Denna siffra har ändrats från Zhang et al.33 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: antal CFU av S. aureus Hämtad från zebrafisk embryon injiceras med inokulat, allt från 6.000 till 200 CFU per embryo och bedömas på 0 till 2 dagar efter injektion. De röda linjerna representerar median antalet CFU. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Antalet CFU och mikroskopiska poängsättning av mCherry protein-uttryckande S. aureus (S. aureus- mCherry) i zebrafiskar embryon, bedömas vid olika tidpunkter. Låg utmaningen dos: 600 CFU per embryo; Hög utmaning dos: 1000 CFU per embryo; PS10: 10 µm PS mikrosfärer; ”+”, embryon injiceras med S. aureus- mCherry tillsammans med PS10; ”-”, embryon injiceras med S. aureus- mCherry endast, så utan PS10. Embryon var mikroskopiskt gjorde för fluorescerande bakterier och väljs slumpmässigt kvantitativa kultur av bakterier efter krossning av embryon på dagen av injektionen gavs (dag 0) och på dag 1 och dag 2 efter injektion. De embryon som mikroskopiskt gjorde positiva och negativa för fluorescerande bakterier visas i röda och svarta prickar, respektive. Numrerar av mikroskopiskt positiva-scoring embryon dividerat med det totala antalet embryon gjorde (frekvens av infekterade embryon) vid varje tidpunkt anges överst i diagrammet. Skillnader i frekvenser av infekterade embryon och antalet CFU mellan S. aureus + PS10 och S. aureus bara grupper vid varje tidpunkt analyserades av Fisher' exakta test och Mann-Whitney test, respektive. p ≤ 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa bilder inspelning infektion progressionen av mCherry-uttryckande S. aureus (en, röd) i närvaro och frånvaro av 10 µm PS mikrosfärer (PS10, blå) och provocerade infiltrationen av Kaede protein-uttryckande makrofager (B, grön) i embryon, från 5 h efter injektion (hpi) till 2 dagar efter injektion (dpi). Icke-behandlade embryon (NT) användes som kontroller. Gula cirklar (100 µm i diameter) ange standardiserade området vid injektionsstället för fluorescens kvantifiering använda filen ObjectJ projekt ”zebrafisk-Immunotest'. Den kvantifierade fluorescensen av bakterier och makrofager avbildas i figur 5. Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: Fluorescens kvantifiering av S. aureus infektion progression och provocerade makrofag infiltrationen i närvaro och frånvaro av 10 µm PS mikrosfärer (PS10) hos zebrafiskar embryon från 5 timmar efter injektion (hpi) till 2 dagar efter injektion (dpi), i ObjectJ Project fil ”zebrafisk-Immunotest”. En standardiserad området vid injektionsstället användes för fluorescens kvantifiering (med en diameter på 100 µm, anges som gula cirklar i figur 4). Icke-behandlade embryon (NT) användes som kontroller. Skillnader mellan varje två grupper på varje gång som punkt analyserades av den Mann-Whitney test, *p ≤ 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biomaterial-associerad infektion (BAI) är en allvarlig klinisk komplikation. En bättre förståelse för patogenesen av BAI invivo skulle ge nya insikter för att förbättra förebyggande och behandling av BAI. Men nuvarande experimentella djurmodeller BAI såsom murina modeller är kostsamma, arbetsintensiva och kräver specialiserad personal utbildad i komplexa kirurgiska tekniker. Dessa modeller är därför inte lämpliga för hög genomströmning analys. Eftersom kraven för zebrafiskar embryo modeller är mindre komplexa och kostnaderna i allmänhet är lägre än för murina modeller, föreliggande studie bedömde om zebrafiskar embryon kan användas som en roman vertebrate djur modell för att utreda BAI i vivo, kompletterar de däggdjur modellerna.
För att ställa upp zebrafiskar embryo BAI modellen, utvecklade vi ett protokoll av samtidig injektion av bakterier och mikrosfärer baserat på en metod för intramuskulär injektion av mikrosfärer i embryon beskrivs innan33. På detta sätt, de flesta av bakterier finns i närheten av mikrosfärerna i embryon, härma bakterier-biomaterial växelverkan som äger rum under eller strax efter implantation av biomaterial i människor/däggdjur.
För att kunna jämföra infektion progression i närvaro och i frånvaro av mikrosfärer i zebrafiskar embryon, bör embryon utmanas med liknande inledande tal av bakterier med och utan mikrosfärer. Men enligt vår erfarenhet, samtidig injektion av bakterier-mikrosfärer suspension resulterar i fler bakterier som injiceras än injektion ”bakterier-bara” suspension. För att lösa problemet, bör förhållandet mellan koncentrationen av bakterier i ”bakterier-bara” suspensioner (utan mikrosfärer) och bakterier-mikrosfärer suspensioner skräddarsys. I den aktuella studien, koncentrationen av S. aureus i ”bakterier-bara” avstängning behövs cirka 1,5 gånger högre än koncentrationen i bakterier-mikrosfärer avstängning. Om detta förhållande gäller även för andra bakteriearter och andra biomaterial återstår att testas. Notera, att injicera liknande antal bakterier med och utan mikrosfärer, bör öppnandet av nålar används för injektioner av antingen suspension vara så nära identiska som möjligt.
Flera egenskaper av ett biomaterial som form och storlek har en viktig roll vid fastställandet av dess inmatningskapacitet och samtidig injektion med bakterier. I denna studie, vi använde 10 µm polystyren mikrosfärer (PS10) som modell biomaterial. Enligt vår erfarenhet är mikrosfärer av en storlek på upp till 15 µm injicerbara i 3 dagar gamla embryon efter protokollet utvecklades i den föreliggande studien33. För mikrosfärer av en relativt stor storlek (t.ex., ≥ 10 µm), Vi avråder från användning av icke-monodispersed eller oregelbundet formade mikrosfärer/mikropartiklar som tenderar att orsaka igensättning av nålen. Om biomaterial i andra former än runda och i olika storlekar är valda för att användas, behöver deras inmatningskapacitet testas. I (co-) injektion av mikrosfärer och bakterier används en 4% polyvinylpyrrolidon (PVP) lösning för att underlätta spridningen. Detta kan vara användbart för injektion av biomaterial med och utan bakterier i embryon i allmänhet.
Som var fallet för injektioner av mikrosfärer bara33,40, varierade numrerar av mikrosfärer som injiceras tillsammans med bakterier i embryon per injektion, mestadels sträcker sig från 1 till 4 mikrosfärer per embryo. Men eftersom sådana variationer inte resulterade i skillnader i provocerade immunceller svaret i embryon33, var de också förväntas inte påverka de potentiella effekterna av mikrosfärer på infektion progression. Dock skulle nya metoder så att injektioner av ett enda microsphere (ensam eller tillsammans med bakterier) önska.
Vi bedömde om mikroskopiska poängsättning av närvaron av fluorescerande bakterier kan användas som ett ”ja eller nej” poängsystem för att analysera infektion progression i levande embryon. Kriteriet om en positiv mikroskopiska Poäng definierades som förekomst av synliga fluorescerande bakterier, oavsett fluorescensintensiteten. Våra representativa resultat jämfört med kvantitativa kultur av bakterier, och föreslog att mikroskopiska scoring kan skilja embryon med 20 eller fler CFU av S. aureus bakterier från embryon med lägre antal CFU eller ingen infektion. Således, eftersom endast låga antalet bakterier krävs för en positiv poäng, denna metod är nästan lika känslig som kvantitativa kultur. Eftersom embryon inte behöver offras och inga avancerade Mikroskop eller sorterings system för fluorescens är skyldig att utföra analyser med hjälp av denna metod, anser vi mikroskopiska scoring en enkel men pålitlig metod för att övervaka infektion progressionen av bakterier i levande embryon. För kvantitativ analys av infektion (i stället för ”Ja eller nej” poängsystem som beskrivs ovan) och immunceller svar i enda levande embryon tillämpade vi ObjectJ projektfilen ”zebrafisk-Immunotest” att kvantifiera fluorescensintensiteten hos fluorescerande bakterier och fluorescerande makrofager registreras över tid. Vi använde ett standardiserat område (med en diameter på 100 m) kring injektionsstället för att mäta fluorescens, eftersom detta område visade sig innehålla en majoritet av bakterierna och infiltrating makrofager. En detaljerad manual för ”zebrafisk-Immunotest” publicerades tidigare33,40. Notera är ”zebrafisk-Immunotest” en öppen tillgång plug-in för ImageJ, som kan anpassas av användaren. Diametern på området för analys och andra parametrar av ”zebrafisk-Immunotest” kan exempelvis ändras fritt enligt studien inställningarna (se exempel i länken som anges i steg 7 i protokollet).
För att visa de möjliga infektion-förbättra effekterna av biomaterial i zebrafiskar embryon, behöver utmaning av bakterier bedömas. I föreliggande studie fann vi att en utmaning dos på 1 000 CFU av S. aureus per embryo eller högre krävs. Högre nivåer av S. aureus infektion i embryon med PS10 än hos dem utan PS10 hittades på de första 2 dagarna efter injektionen, vilket indikerar att närvaro av biomaterial normalnivå underlättar utväxt av S. aureus i embryon. Om infektion ligger kvar på höga nivåer i närvaro av biomaterial vid senare tidpunkter bör studeras äldre embryon under etiskt godkännande enligt gällande föreskrifter. Eftersom clearance av S. aureus i zebrafiskar embryon är främst beroende av fagocytos och dödande av makrofager och neutrofiler23,24, utväxten av bakterier kan förklaras av en minskad effektivitet av den fagocyter att döda bakterierna på grund av biomaterial. Detta är i linje med den välkända infektion-risk förbättringen av biomaterial i patienter2,4,15, också vanligen observerats i mer komplexa djurmodeller som mus och andra djurmodeller10 ,11,12,13. Utöver S. aureus infektion, kan infektion progression av S. epidermidis eller andra patogener i närvaro av biomaterial undersökas efter det protokoll som beskrivs i föreliggande studie. Från punkten biomaterial, kan flera materialegenskaper (t.ex., kemiska sammansättning, vattenavvisande egenskaper, ojämnheter och ytladdningar) påverka de cellulära svar och/eller bakterier-material interaktion41, 42. vår tidigare studie har visat att injektion av ett biomaterial (i närvaro av PVP) provocerade en starkare makrofag infiltration jämfört med injektion av endast PVP i zebrafiskar embryon. Dessutom Sebrafisken embryon reagerat annorlunda på mikrosfärer av poly (-kaprolakton) och polystyren33. Därför kan injektion av mikrosfärer av olika slag har också differentiella effekter på förbättring av infektion som relativt enkelt kan bedömas av den metod som beskrivs här.
För fortsatt utveckling, kan denna zebrafiskar embryo BAI modell ändras för en hög genomströmning system med automatisk robotic injektion27,43, komplexa objekt parametrisk analys och sortering (COPAS) system och hög genomströmning RNA-sekvens analys27,44. Sådana zebrafiskar embryo-baserade hög genomströmning BAI modeller kan användas som hela djur system för in-vivo screening och testning (roman) anti-infektiösa biomaterial samt provning av effekten av antibiotika behandlingar eller andra anti-BAI-strategier. Intracellulär överlevnad är dessutom en större strategi av bakterier överleva i närvaro av biomaterial9,10,11,12,13. Nyttan av zebrafisk embryon för att studera intracellulära infektion har visats i flera studier36,46. Således användas vår embryo modell att studera intracellulär överlevnad av stafylokocker eller andra intracellulära patogener i närvaro av biomaterial och strategier för att behandla sådana intracellulära infektioner. Dessutom kan in situ hybridisering tekniker45 användas i modellen för att studera påverkan av bakterier eller biomaterial eller deras kombination på uttrycket av vissa gener vid injektionsstället, vilket kan vara användbart att upptäcka markörgener för BAI.
Sammanfattningsvis visar den aktuella studien potentialen hos zebrafiskar embryon med de metoder som utvecklats här för att studera biomaterial-associerad infektion i realtid invivo. Denna zebrafiskar embryo modell användas därför att undersöka nya infektion-resistenta biomaterial och lovande förebyggande och behandlingsstrategier av BAI, och gapet mellan in vitro-studier och större djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie var ekonomiskt stöd av IBIZA projektet av biomedicinska Material (BMM) programmet och medfinansieras av det nederländska ekonomiministeriet. Författarna vill tacka Prof. Dr. Graham Lieschke från Monash University, Australien för att tillhandahålla zebrafiskar transgena linjen (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2 mL pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri dish | Falcon | 353003 | |
| Petri dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
References
- Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
- Otto, M. Staphylococcus epidermidis - the 'accidental' pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
- Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
- Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
- Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
- Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
- Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
- Darouiche, R. O. Current concepts - Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
- Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
- Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. , Springer. New York, NY, USA. 307-354 (2013).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
- Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
- van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
- Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
- Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
- Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
- Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
- Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -V. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. , Oxford University press. Oxford, UK. 7-37 (2002).
- Chaplin, W. T. P. Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , Queen's University. Master thesis (2017).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
- Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
- Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
- Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
- Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).
