زراعة البكتيريا ماجنيتوتاكتيك من جنس ماجنيتوسبيريلوم: سلالات MSR-1، السفير-1 ومرض التصلب العصبي المتعدد-1
Summary
نقدم إجراء لزراعة سلالات العديد من ماجنيتوسبيريلوم في نوعين مختلفين من وسائط النمو. سلالة جريفيسوالدينسي ماجنيتوسبيريلوم MSR-1 يزرع في السائل والانحدار تركيز O2 وسائل الإعلام شبه صلبة بينما تزرع ماجنيتيكوم م. سلالة السفير-1 وسلالة M. magnetotacticum MS-1 في المتوسط السائل.
Abstract
يتم ماجنيتوتاكتيك البكتيريا سلبية الغرام، متحركة، أساسا المائية بدائيات النوى في كل مكان في موائل المياه العذبة والبحرية. أنها تتميز بقدرتها على ماجنيتوسوميس بيومينيراليزي، والمغناطيسية نانومتر الحجم بلورات من أكسيد الحديد الأسود (Fe3س4) أو جريجيتي (Fe3ق4) يحيط بها غشاء بلير دهن، داخل بهم السيتوبلازم. لمعظم البكتيريا المعروفة ماجنيتوتاكتيك، ويتم تجميع ماجنيتوسوميس في سلاسل داخل السيتوبلازم، مما يمنح لحظة ثنائي القطب مغناطيسي دائم للخلايا وتسبب لهم بمحاذاة صورة سلبية مع المجالات المغناطيسية الخارجية. وبسبب هذه الميزات المحددة، البكتيريا ماجنيتوتاكتيك على إمكانيات كبيرة للتطبيقات التجارية والطبية. ومع ذلك، معظم الأنواع ميكروايروفيليك وقد س2 تركيز المتطلبات المحددة، يجعلها أكثر صعوبة تنمو بشكل روتيني من العديد من البكتيريا الأخرى مثل الإشريكيّة القولونية. نقدم هنا بروتوكولات مفصلة لزراعة ثلاثة سلالات درس على نطاق واسع من البكتيريا ماجنيتوتاكتيك، ينتمون إلى جنس ماجنيتوسبيريلومجميعا. تسمح هذه الطرق لمراقبة دقيقة من تركيز2 س تتاح للبكتيريا، بغية ضمان أن ينمو بشكل طبيعي وتوليف ماجنيتوسوميس. زراعة البكتيريا ماجنيتوتاكتيك لإجراء المزيد من الدراسات باستخدام هذه الإجراءات لا تتطلب experimentalist إلى أن يكون خبيراً في علم الأحياء المجهرية. كما يمكن استخدام الأساليب العامة الواردة في هذه المقالة لعزل والثقافة الأخرى البكتيريا ماجنيتوتاكتيك، على الرغم من أنه من المرجح أن التركيب الكيميائي وسائط النمو سوف تحتاج إلى تعديل.
Introduction
بكتيريا ماجنيتوتاكتيك (MTB) تمثل نطاقا واسعاً من الغرام بدائيات النوى في كل مكان في الموائل المائية في المياه العذبة والبحرية1. حصة هذه البكتيريا القدرة على إنتاج بلورات مغناطيسية مصنوعة من أكسيد الحديد الأسود (Fe3س4) أو جريجيتي (Fe3ق4)، التي في معظم الحالات تجميعها في سلاسل داخل الخلايا. هذا الحافز الهيكلي خاصة نظراً لوجود عدة بروتينات محددة تتصرف في السيتوبلازم من البكتيريا والغشاء الدهني الذي يحيط بكل كريستال2على حد سواء. كل كريستال الفردية وحويصله الأغشية المحيطة به يسمى ماجنيتوسومي وهي تتراوح في حجمها من حوالي 30 إلى 50 نانومتر في الأنواع ماجنيتوسبيريلوم 3. بسبب ترتيب سلسلة ماجنيتوسوميس، تمتلك هذه البكتيريا لحظة ثنائي القطب مغناطيسي دائم يجعلها في محاذاة صورة سلبية مع المجالات المغناطيسية تطبيق خارجياً. ولذلك، هذه البكتيريا السباحة بنشاط على طول خطوط الحقل المغناطيسي، بوصفها البوصلات الصغيرة ذاتية يفترض أن أكثر فعالية تحديد الظروف المواتية الأكثر (مثلاً.، تركيز O2 ) للنمو.
خاصية مثيرة لاهتمام للمواضيع المتميزة هي قدرتها على تنظيم الكيمياء وعلم البلورات من بلورات ماجنيتوسومي بهم. معظم سلالات إنتاج بلورات نقاء عالية نسبيا من أكسيد الحديد الأسود أو جريجيتي، على الرغم من أن بعض بيومينيراليزي كل المعادن4. وفي جميع الحالات، البكتيريا قادرة على التحكم بدقة في الحجم وشكل بلورات مفردة المجال المغناطيسي بهم. وهذا يفسر لماذا يجري قدرا كبيرا من البحث التوصل إلى فهم أفضل لكيفية أداء MTB هذه العملية بيومينيراليزيشن. فهم هذه العملية قد تمكن الباحثون خياط–جعل نانوكريستالس المغناطيسي للعديد من التطبيقات التجارية والطبية.
وقد يشكل عقبة كبيرة لبحوث مستفيضة في المواضيع المتميزة صعوبة متزايدة منهم في المختبر. معظم الأنواع، بما في ذلك السلالات المستخدمة في هذا العمل، أوبليجاتيلي ميكروايروفيليك عندما نمت مع س2 يقبلون إلكترون المحطة طرفية. وهذا يفسر لماذا توجد هذه البكتيريا في أغلب الأحيان في منطقة انتقالية بين ظروف أوضاع مؤكسدة ووصول (واجهة أوضاع مؤكسدة وصول، OAI). وهذا يبين بوضوح أن MTB دقيقة س2 متطلبات التركيز الذي من الواضح أنه يحتاج إلى أن تؤخذ في الاعتبار عند وضع وسائط النمو لهذه الكائنات. وعلاوة على ذلك، يعني التنوع الكبير الموجود في المواضيع المتميزة أن سلالات مختلفة سوف تحتاج إلى أنواع مختلفة من التدرجات الكيميائية والمواد الغذائية لتحقيق النمو الأمثل.
في هذا العمل، يمكننا وصف أساليب زراعة ثلاثة من المواضيع المتميزة على نطاق واسع أهم درس: ماجنيتيكوم ماجنيتوسبيريلوم (سلالة السفير-1) و M. magnetotacticum (MS-1) م. جريفيسوالدينسي (MSR-1). هذه الأنواع تنتمي إلى فئة الفابروتيوباكتيريا في الأسرة في اللغات بروتيوباكتيريا فيلوجينيتيكالي وهي حلزونية في التشكل، وامتلاك السوط قطبي في نهاية كل من الخلية. نحن نقدم البروتوكولات لزراعة سلالة MSR-1 في كل من السائل ويا2 الانحدار تركيز شبه صلبة وسائل الإعلام، استناداً إلى وصفات متوسطة المنشورة سابقا5،6. ونقدم أيضا بروتوكول مفصل لزراعة سلالات السفير-1 و 1-مرض التصلب العصبي المتعدد في المعدل المتوسط النمو الوشيقي المغناطيسي (مجسم)7.
Protocol
Representative Results
Discussion
س2 تركيز المتطلبات المحددة المواضيع المتميزة وجعلها غير عادية تنمو في المختبر. خطوة أساسية للبروتوكول من أجل المتوسط السائل هو إزالة جميع س2 من المتوسطة الأولى بغية التحكم بتركيز نهائي عن طريق إضافة وحدة تخزين محددة من س2، فقط قبل التطعيم. فقد ثبت أن ينمو MSR-1 الظروف الهوائ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر ريتشارد فرانكل باء لمساعدته مع الثقافات وآدم ص هيتشكوك وإرادات تشو لتأييدهم حين إعداد ثقافات المواضيع المتميزة في جامعة ماكماستر وريد مارسيا المواضيع المتميزة للتدريب والوصول إلى مرفق الميكروسكوب الإلكتروني (جامعة ماكماستر، كلية العلوم الصحية). كان يدعمها هذا العمل في العلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة) ومؤسسة العلوم الوطنية الأمريكية.
Materials
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 – 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621 (2016).
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A ‘capillary racetrack’ method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
