Выращивание магнетотактик бактерии рода Magnetospirillum: штаммов MSR-1, АМБ-1 и MS-1
Summary
Мы представляем процедура для выращивания несколько штаммов Magnetospirillum в двух различных типов питательных сред. Magnetospirillum gryphiswaldense штамм MSR-1 выращивается в жидкости и градиент концентрации2 O полутвердых СМИ, а . м. magneticum штамм AMB-1 и м. magnetotacticum штамм MS-1 выращиваются в жидкой среде.
Abstract
Магнетотактик бактерии являются грамотрицательные, подвижные, главным образом водных прокариот повсеместно в пресноводных и морских местообитаний. Они характеризуются их способность biomineralize magnetosomes, которые являются магнитные нанометрового размера кристаллы магнетита (Fe3O4) или greigite (Fe3S4) окружен липидного бислоя мембраны, в пределах их цитоплазме. Для большинства известных магнетотактик бактерий magnetosomes собираются в цепях внутри цитоплазмы, тем самым наделения постоянного магнитный дипольный момент для клеток и вызывая их для выравнивания пассивно с внешними магнитными полями. Из-за этих особенностей магнетотактик бактерии имеют большой потенциал для коммерческих и медицинских приложений. Однако большинство видов являются микроаэрофильных и имеют особые O2 концентрация требования, что делает их труднее расти регулярно, чем многих других бактерий, таких как кишечная палочка. Здесь мы представляем подробные протоколы для выращивания три из наиболее широко изученных штаммов бактерий магнетотактик, все принадлежащие к роду Magnetospirillum. Эти методы позволяют для точного контроля концентрации2 O распоряжение бактерий, для того чтобы обеспечить что они нормально расти и синтезировать magnetosomes. Выращивание магнетотактик бактерий для дальнейших исследований с использованием этих процедур не требуется экспериментатор быть экспертом в микробиологии. Общие методы, представленные в этой статье может также использоваться для изоляции и культуры других магнетотактик бактерий, хотя вполне вероятно, что рост СМИ химический состав будет необходимо изменить.
Introduction
Магнетотактик бактерий (MTB) представляют широкий спектр грамотрицательные прокариот повсеместно в пресноводных и морских водной среды обитания1. Эти бактерии имеют возможность производить магнитные кристаллы магнетита (Fe3O4) или greigite (Fe3S4), которые в большинстве случаев, смонтирован в цепи внутри клетки. Этот особый структурный мотив это связано с наличием нескольких специфических белков, действуя как в цитоплазме бактерий и липидные мембраны, которая окружает каждый кристалл2. Каждый индивидуальный кристалл и его окружающие везикул мембранных называется Магнетосома и колебаясь в размере от 30 до 50 Нм в Magnetospirillum видов3. Из-за расположения цепь magnetosomes эти бактерии обладают постоянный магнитный дипольный момент, что делает их выровнять пассивно внешне прикладной магнитными полями. Таким образом, эти бактерии активно поплавать вдоль силовых линий магнитного поля, действуя как самоходные микро Компасы предположительно к более эффективно найти наиболее выгодные условия (например., концентрация2 O) для роста.
Интересное свойство MTB является их способность регулировать химии и кристаллография их Магнетосома кристаллов. Большинство штаммов производят относительно высокой чистоты кристаллы магнетита или greigite, хотя некоторые biomineralize обоих минералов4. Во всех случаях бактерии способны точно контролировать размер и форма их однодоменная магнитных кристаллов. Это объясняет, почему большое количество исследований проводится в целях лучшего понимания как MTB выполнить этот процесс biomineralization. Понимание этого процесса может позволить исследователям сделать портной-магнитные нанокристаллов для многих коммерческих и медицинских приложений.
Является существенным препятствием для обширные исследования по MTB была сложность выращивать их в лаборатории. Большинство видов, в том числе штаммов, используемых в этой работе, являются obligately микроаэрофильных когда выросла с2 O как терминал электрон акцептора. Это объясняет, почему эти бактерии наиболее часто встречаются в переходной зоне между аэробных и анаэробных условиях (аэробных и анаэробных интерфейс, OAI). Это ясно показывает, что MTB имеют точные требования концентрация O2 , в которых очевидно, что необходимо принимать во внимание при разработке питательных сред для этих организмов. Кроме того большое разнообразие существующих MTB подразумевает, что различные штаммы понадобятся различные химические градиенты и питательных веществ для достижения оптимального роста.
В этой работе, мы описываем методы для выращивания три из наиболее широко изучены MTB: Magnetospirillum magneticum (штамм AMB-1), м. magnetotacticum (МС-1) и м. gryphiswaldense (МСР-1). Эти виды филогенетически принадлежат к классу Alphaproteobacteria в тип бактерии по алфавиту , винтовой в морфологии и обладают полярных жгутика на каждом конце ячейки. Мы предоставляем протоколы для выращивания штамма MSR-1 в жидкости и O2 градиент концентрации полутвердых средства массовой информации, основанные на ранее опубликованные средний рецепты5,6. Мы также представляем подробный протокол для выращивания штаммов AMB-1 и MS-1 в изменение магнитного Spirillum роста среднего (MGSM)7.
Protocol
Representative Results
Discussion
O2 концентрация требования MTB делают их нетривиальных расти в лаборатории. Ключевым шагом протокола для жидкой среды является первоначальное удаление всех O2 с носителя для управления конечной концентрации, добавляя определенный объем O2, как раз перед прививкой. Было п…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим за его помощь с MTB культур, Адам P. Hitchcock и Чжу Ксяохуи за их поддержку при создании MTB культур в университете МакМастер и Марсия Рид для профессиональной подготовки и доступа к Фонду электронной микроскопии (Университет Макмастера, Ричард б. Френкель Факультет наук о здоровье). Эта работа была поддержана естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ) и нас национального научного фонда.
Materials
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 – 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621 (2016).
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A ‘capillary racetrack’ method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
