Groeiende Magnetotactic bacteriën van het geslacht Magnetospirillum: stammen MSR-1, AMB-1 en MS-1
Summary
Presenteren we een procedure voor het kweken van verschillende stammen van Magnetospirillum in twee verschillende soorten media groei. Magnetospirillum gryphiswaldense stam MSR-1 groeit zowel in vloeibare als in O2 concentratie verloop semi-vaste voedingsbodems terwijl M. magneticum stam AMB-1 en M. magnetotacticum stam MS-1 worden geteeld in vloeistof.
Abstract
Magnetotactic bacteriën zijn gram-negatieve, sporenvormende, hoofdzakelijk aquatische prokaryoten alomtegenwoordig in zoetwater- en mariene habitats. Ze worden gekenmerkt door hun vermogen om te biomineralize magnetosomes, die magnetische nanometer middelgrote kristallen van magnetiet (Fe3O4) of greigiet (Fe3S4 zijn) omgeven door een lipide dubbelgelaagde membraan, binnen hun cytoplasma. Voor de meeste bekende magnetotactic bacteriën, worden magnetosomes geassembleerd in ketens in het cytoplasma, waardoor verlenen een permanente magnetische dipoolmoment op de cellen, en waardoor ze passief uitlijnen met externe magneetvelden. Vanwege deze specifieke kenmerken hebben magnetotactic bacteriën een groot potentieel voor commerciële en medische toepassingen. Echter, de meeste soorten zijn microaerophilic en hebben specifieke O2 concentratie vereisten, waardoor ze moeilijker te groeien routinematig dan veel andere bacteriën zoals Escherichia coli. Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor het kweken van drie van de meest bestudeerde stammen van magnetotactic bacteriën, alle behorend tot het geslacht Magnetospirillum. Deze methoden toestaan voor een nauwkeurige besturing van de concentratie van O2 ter beschikking gesteld van de bacteriën, om ervoor te zorgen dat ze normaal groeien en synthetiseren van magnetosomes. Groeiende magnetotactic bacteriën voor verdere studies met behulp van deze procedures vereist geen het Vejle te worden een expert in de microbiologie. De algemene methoden gepresenteerd in dit artikel kunnen ook worden gebruikt om te isoleren en cultuur van de andere magnetotactic bacteriën, hoewel het is waarschijnlijk dat groei media chemische samenstelling zal moeten worden gewijzigd.
Introduction
Magnetotactic bacteriën (MTB) vertegenwoordigen een breed scala van gram-negatieve prokaryoten alomtegenwoordig in zoet water en mariene aquatische habitats1. Deze bacteriën delen het vermogen te produceren van magnetische kristallen gemaakt van magnetiet (Fe3O4) of greigiet (Fe3S4), die in de meeste gevallen geassembleerd in ketens in de cellen. Dit bijzondere structurele motief is te wijten aan de aanwezigheid van verschillende specifieke proteïnen die zowel in het cytoplasma van de bacteriën en op het lipide membraan dat elke crystal2 omringt. Elke individuele crystal en haar omringende membraan vesikel heet een magnetosome en is variërend in grootte van ongeveer 30 tot 50 nm in3soorten Magnetospirillum . Vanwege de rangschikking van de keten van magnetosomes bezitten deze bacteriën een permanente magnetische dipoolmoment dat maakt ze passief uitlijnen met extern toegepaste magnetische velden. Daarom deze bacteriën actief zwemmen langs de magnetische veldlijnen, handelend als zelfrijdende micro-kompassen vermoedelijk tot meer effectief de meest gunstige omstandigheden zoeken (bv., O2 concentratie) voor groei.
Een interessante eigenschap van MTB is hun vermogen om zowel de chemie en de kristallografie van hun magnetosome kristallen te regelen. De meeste stammen produceren relatief hoge zuiverheid kristallen van hetzij magnetiet hetzij greigiet, hoewel sommige biomineralize beide mineralen4. In alle gevallen kunnen de bacteriën exact bepalen de grootte en de vorm van hun één magnetische domein kristallen. Dit verklaart waarom een grote hoeveelheid onderzoek is begonnen met het ontwikkelen van een beter begrip van hoe MTB voeren dit biomineralization proces. Inzicht in dit proces mogelijk de onderzoekers te kleermaker-merk magnetisch nanokristallen voor veel commerciële en medische toepassingen.
Een aanzienlijke belemmering voor uitgebreid onderzoek op MTB is de moeilijkheid van het kweken van hen in het laboratorium. De meeste soorten, met inbegrip van de spanningen in dit werk gebruikt zijn obligately microaerophilic als volwassen met O2 als een accepteerder terminal elektron. Dit verklaart waarom deze bacteriën zijn meestal te vinden op het overgangsgebied tussen oxic en zuurstofvrije omstandigheden (de IME-zuurstofvrije interface, OAI). Dit toont duidelijk aan dat MTB hebben precieze O2 concentratie vereisten die natuurlijk moet rekening worden gehouden bij het opstellen van groei media voor deze organismen. Bovendien, de grote bestaande diversiteit aan MTB betekent dat verschillende soorten verschillende soorten chemische verlopen en voedingsstoffen om optimale groei te realiseren zal moeten.
In dit werk, beschrijven we de methoden voor de teelt van drie van de meest bestudeerde MTB: Magnetospirillum magneticum (stam AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) en M. gryphiswaldense (MSR-1). Deze soorten behoren tot de klasse van de Alphaproteobacteria in de stam van de Proteobacteria fylogenetisch, zijn spiraalvormige in morfologie en bezitten een polar flagellum aan elk uiteinde van de cel. Wij bieden de protocollen voor de groeiende stam MSR-1 in zowel vloeibare als O2 concentratie verloop semi-vaste voedingsbodems, gebaseerd op eerder gepubliceerde middellange recepten5,6. Ook presenteren we een gedetailleerd protocol voor de teelt van stammen AMB-1 en MS-1 in gewijzigde magnetische Spirillen groei Medium (MGSM)7.
Protocol
Representative Results
Discussion
De specifieke O2 concentratie vereisten van MTB maken hen niet-triviaal om te groeien in het laboratorium. Een belangrijke stap van het protocol voor opgietvloeistof is de eerste verwijdering van alle O2 van het middel om de uiteindelijke concentratie door het toevoegen van een bepaald volume van O2, vlak voor de inenting. Het is gebleken dat MSR-1 groeit onder bijna volledig aërobe omstandigheden, echter het magnetisme van de cellen wordt drastisch verminderd. Uit hetzelfde onderzoek bl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij Richard B. Frankel bedanken voor zijn hulp met MTB culturen, Adam P. Hitchcock Xiaohui Zhu voor hun steun bij het opzetten van de MTB-culturen op McMaster University en Marcia Reid voor opleiding en toegang tot de faciliteit van elektronenmicroscopie (McMaster University, Faculteit der medische wetenschappen). Dit werk werd gesteund door de natuurwetenschappen, Engineering onderzoek Raad van Canada (NSERC) en de ons National Science Foundation.
Materials
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 – 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621 (2016).
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A ‘capillary racetrack’ method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
