Cultivo de bacterias magnétotactiques del género Magnetotacticum: cepas MSR-1, 1 AMB y MS-1
Summary
Presentamos un procedimiento para el crecimiento de varias cepas de Magnetotacticum en dos tipos diferentes de medios de cultivo. Cepa gryphiswaldense Magnetotacticum MSR-1 se cultiva en líquido y gradiente de la concentración de O2 medios semisólidos mientras M. magneticum cepa 1 AMB y M. Magnetospirillum cepa MS-1 se cultivan en medio líquido.
Abstract
Magnétotactiques bacterias son procariotas Gram-negativos, móviles, principalmente acuáticos ubicuos en hábitats de agua dulce y marinos. Se caracterizan por su capacidad de magnetosomes biomineralize, que son magnéticos cristales tamaño de nanómetros de magnetita (Fe3O4) o greigite (Fe3S4) rodeados por una membrana de bicapa lipídica, en su citoplasma. Para la mayoría de las bacterias conocidas magnétotactiques, magnetosomes se montan en cadenas dentro del citoplasma, lo que confiere un permanente momento de dipolo magnético a las células y haciendo que alinear pasivamente con campos magnéticos externos. Debido a estas características específicas, magnétotactiques las bacterias tienen un gran potencial para aplicaciones comerciales y médicas. Sin embargo, la mayoría de especies son microaerofílicas y O2 concentración requisitos específicos, haciéndolos más difícil de cultivar rutinariamente que muchas otras bacterias como Escherichia coli. Aquí presentamos protocolos detallados para el cultivo de tres de las cepas más ampliamente estudiadas de bacterias magnétotactiques, todos pertenecientes al género Magnetotacticum. Estos métodos permiten un control preciso de la concentración de O2 a disposición de las bacterias, con el fin de asegurarse de que crecen normalmente y sintetizar magnetosomes. Cultivo de bacterias magnétotactiques para futuros estudios con estos procedimientos no requiere el experimentador a ser un experto en Microbiología. Los métodos generales presentados en este artículo pueden usarse para aislar y cultura otras bacterias magnétotactiques, aunque es probable que composición química de los medios de crecimiento tendrán que modificarse.
Introduction
Magnétotactiques bacterias (MTB) representan una amplia gama de procariotas gramnegativos ubicuos en ambientes acuáticos de agua dulce y marinos1. Estas bacterias comparten la habilidad de producir cristales magnéticos de magnetita (Fe3O4) o greigite (Fe3S4), que son en la mayoría de los casos montada en cadenas dentro de las células. Este motivo estructural particular es debido a la presencia de varias proteínas específicas que actúan tanto en el citoplasma de la bacteria y la membrana lipídica que envuelve cada cristal2. Cada cristal individual y su vesícula de membrana circundante se llama un magnetosome y es que van en tamaño desde unos 30 a 50 nm en Magnetotacticum especies3. Debido a la disposición de la cadena de magnetosomes, estas bacterias poseen un permanente momento de dipolo magnético que hace alinear pasivamente con campos magnéticos aplicados externamente. Por lo tanto, estas bacterias nadan activamente a lo largo de líneas del campo magnético, actuando como automotores micro-brújulas presumiblemente más efectivamente localizar las condiciones más favorables (por ej., concentración de O2 ) para el crecimiento.
Una propiedad interesante de MTB es su capacidad para regular la química y la cristalografía de los cristales de magnetosome. Mayoría de las cepas produce cristales de pureza relativamente elevada de magnetita o greigite, aunque algunos biomineralize ambos minerales4. En todos los casos, las bacterias son capaces de controlar con precisión el tamaño y la forma de sus cristales solo dominio magnético. Esto explica por qué una gran cantidad de investigación se lleva a cabo para desarrollar una mejor comprensión de cómo MTB realizar este proceso de biomineralización. Comprender este proceso permitiría a los investigadores a adaptar-hacer nanocristales magnéticos para muchos usos médicos y comerciales.
Un obstáculo importante a la investigación extensa sobre MTB ha sido la dificultad de cultivarlas en el laboratorio. Mayoría de las especies, incluyendo las cepas utilizadas en este trabajo, es obligatoriamente microaerofílico cuando se cultiva con O2 como aceptor terminal de electrones. Esto explica por qué estas bacterias más a menudo se encuentran en la zona de transición entre condiciones anóxicas y óxicas (la interfaz oxic-anoxic, OAI). Esto claramente muestra que MTB O2 concentración requerimientos precisos que obviamente debe tenerse en cuenta al elaborar medios de cultivo para estos organismos. Por otra parte, la gran diversidad existente de MTB implica que diferentes cepas tendrán diferentes tipos de gradientes químicos y nutrientes para lograr un crecimiento óptimo.
En este trabajo, describimos los métodos para el cultivo de tres de la MTB más ampliamente estudiado: magneticum Magnetotacticum (cepa AMB-1), M. Magnetospirillum (MS-1) y M. gryphiswaldense (MSR-1). Estas especies pertenecen a la clase Alphaproteobacteria en el phylum proteobacterias filogenéticamente, son helicoidales en morfología y poseen un flagelo polar en cada extremo de la célula. Proporcionamos los protocolos para el cultivo de cepa MSR-1 en líquido y O gradiente de concentración semisólidos medios2 , basados en recetas medio previamente publicados5,6. También presentamos un protocolo detallado para el cultivo de cepas 1 AMB y 1 MS en modificado magnético Spirillum crecimiento medio (MGSM)7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los requisitos específicos de concentración de2 O de MTB hacen no trivial para crecer en el laboratorio. Un paso clave del Protocolo de medio líquido es la eliminación inicial de todos O2 del medio para el control de la concentración final mediante la adición de un volumen definido de O2, justo antes de la inoculación. Se ha demostrado que el MSR-1 crece en condiciones aerobias casi completamente, sin embargo, el magnetismo de las células se reduce drásticamente. Los resultados d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Richard B. Frankel por su ayuda con MTB culturas Adam P. Hitchcock y Xiaohui Zhu su apoyo durante la configuración de las culturas MTB en la Universidad de McMaster y Marcia Reid para la formación y el acceso a las instalaciones de microscopía electrónica (McMaster University, Facultad de Ciencias de la salud). Este trabajo fue apoyado por las ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC) y la Fundación Nacional de ciencia.
Materials
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 – 12 N |
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