Wachsende Magnetotaktische Bakterien der Gattung Magnetospirillum: Stämme MSR-1, AMB-1 und MS-1
Summary
Wir präsentieren ein Verfahren für den Anbau von mehrere Stämme von Magnetospirillum in zwei verschiedene Arten von Wachstumsmedium. Magnetospirillum Gryphiswaldense Stamm MSR-1 ist in Flüssigkeit und O2 Konzentrationsgefälle halbfeste Medien gewachsen, während M. Magneticum Belastung AMB-1 und M. Magnetotacticum Belastung MS-1 im flüssigen Medium gewachsen sind.
Abstract
Magnetotaktische Bakterien sind Gramnegative, bewegliche, vor allem aquatische Prokaryoten allgegenwärtig in Süßwasser und marinen Habitaten. Sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit, Biomineralize magnetosomen, die magnetische nanometergroßen Kristalle von Magnetit (Fe3O4) oder Greigite (Fe3S4) umgeben von einer Lipidmembran Bilayer innerhalb ihrer Zytoplasma. Für die meisten bekannten Magnetotaktische Bakterien sind magnetosomen in Ketten in das Zytoplasma, dadurch konferieren eine dauerhafte magnetische Dipolmoment zu den Zellen und wodurch sie passiv mit externen Magnetfeldern ausrichten zusammengestellt. Aufgrund dieser Besonderheiten haben Magnetotaktische Bakterien ein großes Potenzial für gewerbliche und medizinische Anwendungen. Aber die meisten Arten sind mikroaerophil und Anforderungen sind in O2 Konzentration, erschweren sie routinemäßig als viele andere Bakterien wie Escherichia coliwachsen. Hier präsentieren wir ausführliche Protokolle für den Anbau von drei der am häufigsten untersuchten Stämme der Magnetotaktische Bakterien, alle gehören zu der Gattung Magnetospirillum. Diese Methoden ermöglichen präzise Steuerung der O2 Konzentration der Bakterien, um sicherzustellen, dass sie normal wachsen und magnetosomen synthetisieren zur Verfügung gestellt. Wachsende Magnetotaktische Bakterien für weitere Studien mithilfe dieser Verfahren erfordert keine der Experimentator, ein Experte in der Mikrobiologie. Die allgemeinen Methoden in diesem Artikel vorgestellten können auch verwendet werden, zu isolieren und Kultur anderen Magnetotaktische Bakterien, obwohl es wahrscheinlich ist, dass Wachstum Medien chemische Zusammensetzung geändert werden muss.
Introduction
Magnetotaktische Bakterien (MTB) repräsentieren ein breites Spektrum von Gram-negativen Prokaryoten in süß- und aquatischen Lebensräumen1allgegenwärtig. Diese Bakterien haben die Fähigkeit, magnetische Kristalle entweder Magnetit (Fe3O4) oder Greigite (Fe3S4), zu produzieren, die in den meisten Fällen zu Ketten im Inneren der Zellen zusammengesetzt sind. Diese besondere strukturmotiv ist aufgrund des Vorhandenseins mehrerer spezifischer Proteine Handeln sowohl im Zytoplasma der Bakterien und auf der Lipidmembran, die jeder Kristall2umgibt. Jeder einzelne Kristall und seine umgebenden Membran Vesikel nennt man eine magnetosomenkristalle und reicht in der Größe von etwa 30 bis 50 nm Magnetospirillum Arten3. Aufgrund der Kette Anordnung der magnetosomen besitzen diese Bakterien eine dauerhafte magnetische Dipolmoment, das macht sie passiv mit externen Magnetfeldern ausrichten. Daher, diese Bakterien aktiv schwimmen entlang der magnetischen Feldlinien, die als selbstfahrende Mikro-Kompasse vermutlich zu mehr effektiv die günstigsten Bedingungen suchen (zB., O2 -Konzentration) für Wachstum.
Eine interessante Eigenschaft von MTB ist ihre Fähigkeit zur Regulierung der Chemie und der Kristallographie magnetosomenkristalle Kristalle. Die meisten Stämme produzieren relativ hochreine Kristalle von Magnetit oder Greigite, obwohl einige Biomineralize beide Mineralien-4. In allen Fällen sind die Bakterien in der Lage, die Größe und die Form der magnetischen Einzeldomäne Kristalle genau zu kontrollieren. Dies erklärt, warum eine große Menge an Forschung unternommen wird, entwickeln ein besseres Verständnis der wie MTB dabei Biomineralisation durchführen. Verständnis dieses Prozesses können die Forscher zu Schneider-magnetischen Nanokristallen für viele gewerbliche und medizinische Anwendungen.
Eine wesentliche Behinderung umfangreiche Forschung auf dem MTB ist die Schwierigkeit, sie im Labor wachsen gewesen. Die meisten Arten, darunter die Stämme, die in dieser Arbeit verwendeten sind obligately mikroaerophil wenn mit O2 als ein terminal Elektron Akzeptor gewachsen. Dies erklärt, warum diese Bakterien in der Übergangszone zwischen oxischen und anoxischen Bedingungen (oxischen anoxischen Interface, OAI) am häufigsten anzutreffen sind. Dies zeigt deutlich, dass MTB haben präzise O2 Konzentration Anforderungen, die offensichtlich bei der Entwicklung von Wachstumsmedium für diese Organismen berücksichtigt werden muss. Darüber hinaus bedeutet die vorhandene Vielfalt der MTB, dass verschiedene Stämme, verschiedene Arten von chemischen Gradienten und Nährstoffe benötigen, um ein optimales Wachstum zu erreichen.
In dieser Arbeit beschreiben wir die Methoden für den Anbau von drei der am häufigsten untersuchten MTB: Magnetospirillum Magneticum (Stamm AMB-1), M. Magnetotacticum (MS-1) und M. Gryphiswaldense (MSR-1). Diese Arten phylogenetisch an der Alphaproteobakterien Klasse der Proteobakterien Stamm gehören, sind spiralförmige Morphologie und besitzen einen polaren Geissel an beiden Enden der Zelle. Wir bieten die Protokolle für den Anbau von MSR-1 Stamm in Flüssigkeit und O2 Konzentrationsgefälle halbfeste Medien, basierend auf bereits veröffentlichte mittlere Rezepte5,6. Außerdem präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für den Anbau von Sorten AMB-1 und MS-1 in veränderten magnetischen Spirillumm Wachstum Medium (MGSM)7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die O2 Konzentration Anforderungen der MTB machen sie nicht-triviale im Labor wachsen. Ein wichtiger Schritt des Protokolls für flüssige Medium ist die anfängliche Entfernung aller O2 vom Medium um die Endkonzentration zu kontrollieren, indem man einem bestimmten Volumen von O2, kurz vor der Impfung. Es hat sich gezeigt, dass MSR-1 wächst fast vollständig aeroben Bedingungen, jedoch der Magnetismus der Zellen wird drastisch reduziert. Die Ergebnisse aus der gleichen Studie zeigte, da…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Richard B. Frankel für seine Hilfe bei MTB-Kulturen, Adam P. Hitchcock und Xiaohui Zhu für ihre Unterstützung beim Aufbau der MTB-Kulturen an der McMaster University und Marcia Reid für Ausbildung und Zugang zu der Elektronenmikroskopie-Anlage (McMaster University, Faculty of Health Sciences). Diese Arbeit wurde von den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC) und der US National Science Foundation unterstützt.
Materials
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 – 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621 (2016).
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A ‘capillary racetrack’ method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
