Crescimento de bactérias de Magnetotactic do género Magnetospirillum magnetotacticum: cepas MSR-1, AMB-1 e MS-1
Summary
Apresentamos um procedimento para o cultivo de várias estirpes de Magnetospirillum magnetotacticum em dois tipos diferentes de meios de crescimento. Magnetospirillum magnetotacticum gryphiswaldense estirpe MSR-1 é cultivado em líquido e O gradiente de concentração de2 meios semi-sólidos enquanto cepa de M. magneticum AMB-1 e M. magnetotacticum cepa MS-1 são cultivadas em meio líquido.
Abstract
Bactérias de magnetotactic são Gram-negativas, motile, principalmente aquáticos procariontes onipresentes em habitats de água doce e marinhos. Eles são caracterizados pela sua capacidade de biomineralizar magnetossomas, que são magnéticos nanômetros de tamanho cristais de magnetita (Fe3O4) ou greigite (Fe3S4) rodeados por uma membrana de bicamada lipídica, dentro deles citoplasma. Para a maioria das bactérias de magnetotactic conhecido, magnetossomas são montadas em correntes dentro do citoplasma, desse modo, conferindo um momento de dipolo magnético permanente para as células e levando-os a alinhar passivamente com campos magnéticos externos. Devido a estas características específicas, bactérias de magnetotactic tem um grande potencial para aplicações comerciais e médicos. No entanto, a maioria das espécies são microaerófila e ter O2 concentração requisitos específicos, tornando-os mais difíceis de crescer, rotineiramente, do que muitas outras bactérias tais como Escherichia coli. Aqui nós apresentamos protocolos detalhados para o cultivo de três das estirpes de bactérias de magnetotactic, todas pertencentes ao gênero Magnetospirillum magnetotacticummais amplamente estudadas. Estes métodos permitem o controle preciso da concentração2 O disponibilizado para as bactérias, a fim de assegurar que eles crescem normalmente e sintetizam magnetossomas. Crescimento de bactérias de magnetotactic para estudos adicionais usando estes procedimentos não exige o experimentalista deve ser um especialista em microbiologia. Os métodos gerais apresentados neste artigo também podem ser usados para isolar e cultura a outras bactérias de magnetotactic, embora seja provável que a composição química de mídia de crescimento precisará ser modificado.
Introduction
Bactérias de magnetotactic (MTB) representam uma ampla gama de bactérias Gram-negativas procariontes onipresentes em habitats aquáticos de água doce e Marinha1. Estas bactérias compartilham a capacidade de produzir cristais magnéticos feitos de magnetita (Fe3O4) ou greigite (Fe3S4), que são na maioria dos casos, montados em cadeias dentro das células. Este motivo estrutural particular é devido à presença de várias proteínas específicas, atuando tanto no citoplasma das bactérias e na membrana lipídica que envolve cada cristal2. Cada cristal individual e suas vesículas de membrana circundante é chamado um magnetosome e está variando em tamanho de cerca de 30 a 50 nm no Magnetospirillum magnetotacticum espécie3. Por causa do arranjo de cadeia de magnetossomas, estas bactérias possuem um momento de dipolo magnético permanente que lhes faz alinhar passivamente aplicados externamente campos magnéticos. Portanto, estas bactérias nadam ativamente ao longo das linhas de campo magnético, atuando como microbússolas automotoras presumivelmente a mais efetivamente localizar as condições mais favoráveis (EG., concentração de O2 ) para o crescimento.
Uma propriedade interessante de MTB é sua capacidade de regular tanto a química e a cristalografia de seus cristais de magnetosome. Maioria das cepas produzem cristais relativamente alta pureza de magnetita ou greigite, embora alguns biomineralizar ambos minerais4. Em todos os casos, as bactérias são capazes de controlar com precisão o tamanho e a forma de seus cristais de único domínio magnético. Isto explica por que uma grande quantidade de pesquisa é realizada para desenvolver um melhor entendimento de como MTB executar esse processo de biomineralização. Compreender esse processo pode permitir que os pesquisadores costurar-fazer nanocristais magnéticos para muitas aplicações comerciais e médicas.
Um obstáculo substancial à extensa pesquisa sobre MTB tem sido a dificuldade de fazê-los crescer em laboratório. A maioria das espécies, incluindo as estirpes utilizadas neste trabalho, são anaeróbias microaerofílicas quando crescido com O2 como um aceitador terminal de electrões. Isto explica por que essas bactérias são mais frequentemente encontradas na zona de transição entre as condições oxic e anóxica (a interface oxic-anóxica, OAI). Isto mostra claramente que MTB têm requisitos de concentração precisos de2 de O que obviamente precisa ser levado em conta quando planear meios de crescimento para esses organismos. Além disso, a grande diversidade existente de MTB implica que vão precisar de diferentes estirpes diferentes tipos de gradientes químicos e nutrientes para alcançar o crescimento ideal.
Neste trabalho, descrevemos os métodos para o cultivo de três o mais extensamente estudada MTB: magneticum Magnetospirillum magnetotacticum (estirpe AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) e M. gryphiswaldense (MSR-1). Estas espécies filogeneticamente pertencem à classe do filo Proteobacteria Alphaproteobacteria , são helicoidais em morfologia e possuem um flagelo polar em cada extremidade da célula. Nós fornecemos os protocolos para o cultivo de estirpe MSR-1 em líquido e O gradiente de concentração semi-sólido mídia2 , com base em receitas médias publicados anteriormente5,6. Também apresentamos um protocolo detalhado para o cultivo de cepas AMB-1 e MS-1 em modificados magnético Spirillum crescimento médio (MGSM)7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os requisitos específicos O2 concentração de MTB torná-los não-trivial para crescer no laboratório. Uma etapa chave do protocolo para o meio líquido é a remoção inicial de todos O2 do meio a fim de controlar a concentração final, adicionando um volume determinado de O2, só antes da inoculação. Tem sido demonstrado que MSR-1 cresce sob condições aeróbias quase totalmente, no entanto, o magnetismo das células é drasticamente reduzido. Os resultados do mesmo estudo mostra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a ajuda com culturas MTB, Adam P. Hitchcock e Xiaohui Zhu pelo seu apoio ao estabelecimento das culturas MTB na McMaster University e Marcia Reid para formação e acesso ao centro de microscopia eletrônica (McMaster University, Richard B. Frankel Faculdade de Ciências da saúde). Este trabalho foi apoiado por ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC) e nos National Science Foundation.
Materials
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 – 12 N |
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