Croissance des bactéries magnétotactiques du genre Magnetospirillum: souches MSR-1, 1-AMB et MS-1
Summary
Nous présentons une procédure pour la culture de plusieurs souches de Magnetospirillum dans deux différents types de milieux de culture. Magnetospirillum gryphiswaldense souche MSR-1 est cultivée en liquide et en gradient de concentration2 O milieu semi solide alors que M. magneticum souche AMB-1 et M. magnetotacticum souche MS-1 sont cultivés en milieu liquide.
Abstract
Magnétostatiques bactéries sont Gram négatifs, mobiles, principalement aquatiques procaryotes omniprésents dans les habitats d’eau douce et marins. Ils sont caractérisés par leur capacité de magnétosomes biomineralize, qui sont magnétiques taille nanométrique cristaux de magnétite (Fe3O4) ou greigite (Fe3S4) entouré d’une membrane lipidique bi-couche, dans leur cytoplasme. Pour la plupart des bactéries magnétotactiques connus, magnétosomes sont assemblés dans les chaînes dans le cytoplasme, ce qui confère un moment magnétique permanent aux cellules et obligeant à aligner passivement avec les champs magnétiques externes. En raison de ces caractéristiques, les bactéries magnétotactiques ont un grand potentiel pour des applications commerciales et médicales. Cependant, la plupart des espèces sont microaérophiles et ont des exigences spécifiques de O2 concentration, ce qui les rend plus difficiles à se développer régulièrement que beaucoup d’autres bactéries comme Escherichia coli. Nous présentons des protocoles détaillés pour la culture de trois des souches de bactéries magnétotactiques, tous appartenant au genre Magnetospirillumplus largement étudiés. Ces méthodes permettent un contrôle précis de la concentration de2 O mis à la disposition de la bactérie, afin de s’assurer qu’ils poussent normalement et synthétisent les magnétosomes. Croissance des bactéries magnétotactiques pour poursuivre ses études à l’aide de ces procédures ne nécessite pas l’expérimentateur d’être un expert en microbiologie. Les méthodes générales présentées dans cet article peuvent aussi servir à isoler et à la culture des autres bactéries magnétotactiques, bien qu’il soit probable que composition chimique de la croissance médias devront être modifiées.
Introduction
Bactéries magnétotactiques (MTB) représentent un large éventail d’omniprésents dans les habitats aquatiques d’eau douce et1gramnégatives procaryotes. Ces bactéries ont la capacité de produire les cristaux magnétiques en magnétite (Fe3O4) ou greigite Fe3S4, qui sont le plus souvent assemblés dans des chaînes à l’intérieur des cellules. Ce motif structural particulière est due à la présence de plusieurs protéines spécifiques agissant aussi bien dans le cytoplasme de la bactérie et sur la membrane lipidique qui entoure chaque cristal2. Chaque cristal individuel et ses vésicules de membrane environnante est appelé un magnétosomale et est variant entre 30 et 50 nm de Magnetospirillum espèces3. En raison de la configuration de la chaîne de magnétosomes, ces bactéries possèdent un moment magnétique permanent qui les rend aligner passivement des champs magnétiques appliqués extérieurement. Par conséquent, ces bactéries activement nagent le long des lignes de champ magnétique, en tant que micro-boussoles automoteurs vraisemblablement à plus localiser efficacement les conditions les plus favorables (e.g., concentration de O2 ) pour la croissance.
Une propriété intéressante de m. tuberculosis est leur capacité à réguler la chimie et la cristallographie de leurs cristaux magnétosomale. La plupart des souches produisent des cristaux relativement haute pureté de magnétite ou greigite, bien que certains biomineralize les deux minéraux4. Dans tous les cas, les bactéries sont capables de contrôler avec précision la taille et la forme de leurs cristaux domaine magnétique unique. C’est ce qui explique pourquoi un grand nombre de recherches est entrepris pour développer une meilleure compréhension de comment MTB effectuer ce processus de biominéralisation. Compréhension de ce processus pourrait permettre aux chercheurs de travailler-faire des nanocristaux magnétiques pour de nombreuses applications commerciales et médicales.
Un obstacle de taille à des recherches approfondies sur les VTT a été la difficulté de leur culture en laboratoire. La plupart des espèces, y compris les souches utilisées dans ce travail, sont obligatoirement microaérophiles lorsqu’il est cultivé avec O2 comme accepteur terminal d’électron. C’est ce qui explique pourquoi ces bactéries se trouvent le plus souvent à la zone de transition entre les conditions oxiques et anoxiques (l’interface oxic-anoxiques, OAI). Cela montre clairement que les VTT ont O2 concentration aux exigences précises qui doit évidemment être pris en compte lorsqu’ils établissent des milieux de culture pour ces organismes. De plus, la grande diversité existante de VTT implique que différentes souches aura besoin de différents types de gradients chimiques et d’éléments nutritifs pour une croissance optimale.
Dans ce travail, nous décrivons les méthodes pour la culture de trois du plus largement étudié VTT : Magnetospirillum magneticum (souche AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) et M. gryphiswaldense (MSR-1). Ces espèces phylogénétiquement appartiennent à la classe Alphaproteobacteria du phylum des Proteobacteria , sont hélicoïdales en morphologie et possèdent un flagelle polaire à chaque extrémité de la cellule. Nous fournissons les protocoles pour la culture de la souche MSR-1 en liquide et en O2 gradient de concentration semi-solide médias, sur la base des recettes moyennes publiées antérieurement5,6. Nous présentons également un protocole détaillé pour la culture de souches AMB-1 et MS-1 mis à jour le magnétique Spirillum croissance moyenne (MGSM)7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les exigences de concentration de2 O spécifiques de m. tuberculosis rendent non négligeable à cultiver en laboratoire. Une étape clé du protocole pour le milieu liquide est la suppression initiale de tous les O2 du milieu afin de contrôler la concentration finale en ajoutant un volume précis d’O2, juste avant l’inoculation. Il a été démontré que MSR-1 pousse dans des conditions aérobies presque complètement, cependant, le magnétisme des cellules est considérablement ré…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Richard B. Frankel pour son aide avec cultures MTB, Adam P. Hitchcock et Xiaohui Zhu pour leur soutien pendant la mise en place des cultures de VTT à l’Université McMaster et Marcia Reid pour la formation et l’accès à la facilité de la microscopie électronique (McMaster University, Faculté des Sciences de la santé). Ce travail a été soutenu par les Sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG) et le US National Science Foundation.
Materials
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 – 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621 (2016).
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A ‘capillary racetrack’ method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
