Crescita di batteri magnetotattici del genere Magnetospirillum: ceppi MSR-1, AMB-1 e MS-1
Summary
Presentiamo una procedura per la coltivazione di diversi ceppi di Magnetospirillum in due diversi tipi di crescita media. Ceppo di Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 viene coltivato in sia liquido e gradiente di concentrazione di O2 terreni semi-solidi mentre M. magneticum ceppo AMB-1 e M. magnetotacticum ceppo MS-1 sono coltivate in terreno liquido.
Abstract
I batteri magnetotattici sono Gram-negativi, mobili, prevalentemente acquatiche procarioti onnipresente in habitat d’acqua dolce e marini. Sono caratterizzati dalla loro capacità di magnetosomes di biomineralize, che sono magnetici dimensioni nanometriche cristalli di magnetite (Fe3O4) o di grigite (Fe3S4) circondati da una membrana lipidica a doppio strato, nelle loro citoplasma. Per la maggior parte dei batteri magnetotattici noto, magnetosomes sono assemblati in catene all’interno del citoplasma, quindi conferendo un momento di dipolo magnetico permanente alle cellule e causando loro di allineare passivamente con campi magnetici esterni. A causa di queste caratteristiche specifiche, batteri magnetotattici hanno un grande potenziale per applicazioni mediche e commerciali. Tuttavia, la maggior parte delle specie sono microaerofili e hanno requisiti specifici O2 concentrazione, che li rende più difficile a crescere regolarmente rispetto a molti altri batteri come Escherichia coli. Qui presentiamo protocolli dettagliati per la coltivazione di tre dei più ampiamente studiati ceppi di batteri magnetotattici, tutti appartenenti al genere Magnetospirillum. Questi metodi consentono un controllo preciso della concentrazione2 O reso disponibile ai batteri, al fine di garantire che si sviluppano normalmente e sintetizzare magnetosomes. Crescita di batteri magnetotattici per ulteriori studi utilizzando queste procedure non richiede lo sperimentalista di essere un esperto in microbiologia. I metodi generali presentati in questo articolo possono anche essere utilizzati per isolare e cultura altri batteri magnetotattici, anche se è probabile che la composizione chimica media di crescita dovrà essere modificato.
Introduction
I batteri magnetotattici (MTB) rappresentano una vasta gamma di procarioti gram-negativi onnipresente in habitat acquatici d’acqua dolce e marini1. Questi batteri condividono la capacità di produrre magnetici cristalli di magnetite (Fe3O4) o grigite (Fe3S4), che sono nella maggior parte dei casi assemblati in catene all’interno delle cellule. Questo particolare motivo strutturale è dovuta alla presenza di numerose proteine specifiche che agiscono sia nel citoplasma dei batteri e sulla membrana del lipido che circonda ogni cristallo2. Ogni singolo cristallo e sua circostante delle vescicole di membrana viene chiamato un magnetosoma ed è che variano nel formato da circa 30 a 50 nm in Magnetospirillum specie3. A causa della disposizione di catena di magnetosomes, questi batteri possiedono un momento di dipolo magnetico permanente che li rende allineare passivamente con campi magnetici applicati esternamente. Di conseguenza, questi batteri nuotano attivamente lungo linee di campo magnetico, che agiscono come semovente micro-Compasso presumibilmente a più efficacemente individuare le condizioni più favorevoli (ad es., concentrazione di O2 ) per la crescita.
Una proprietà interessante della MTB è la loro capacità di regolare sia la chimica e la cristallografia dei loro cristalli magnetosoma. Maggior parte dei ceppi produrre relativamente elevata purezza cristalli di magnetite o greigite, anche se alcuni biomineralize entrambi minerali4. In tutti i casi, i batteri sono in grado di controllare con precisione le dimensioni e la forma dei loro cristalli di singolo dominio magnetico. Questo spiega perché una grande quantità di ricerca è impegnata a sviluppare una migliore comprensione di come MTB eseguire questo processo biomineralization. Comprensione di questo processo potrebbe consentire ai ricercatori di adattare-fare nanocristalli magnetici per molte applicazioni mediche e commerciali.
Un ostacolo sostanziale al ricerche approfondite su MTB è stata la difficoltà della loro coltivazione in laboratorio. Maggior parte delle specie, tra cui i ceppi utilizzati in questo lavoro, sono obligately microaerofili se coltivata con O2 come un accettore terminale di elettroni. Questo spiega perché questi batteri si trovano più spesso la zona di transizione tra condizioni ossidanti e anossiche (l’interfaccia ossica-anossico, OAI). Ciò dimostra chiaramente che la MTB hanno precise esigenze di concentrazione di O2 che ovviamente deve essere presa in considerazione quando si concepisce la crescita media per questi organismi. Inoltre, la grande varietà esistente di MTB implica che diversi ceppi saranno necessari diversi tipi di gradienti chimici e sostanze nutrienti per ottenere una crescita ottimale.
In questo lavoro descriviamo i metodi per la coltivazione di tre di MTB più ampiamente studiati: Magnetospirillum magneticum (ceppo AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) e M. gryphiswaldense (MSR-1). Queste specie filogeneticamente appartengono alla classe di Alphaproteobacteria , nel phylum Proteobacteria , sono elicoidale nella morfologia e possiedono un flagello polare a ciascuna estremità della cella. Forniamo i protocolli per la coltivazione di ceppo MSR-1 sia liquido e O2 gradiente di concentrazione media semi-solido, basato su ricette medie precedentemente pubblicate5,6. Inoltre presentiamo un protocollo dettagliato per la crescita di ceppi AMB-1 e MS-1 nelle modificate magnetico Spirillum crescita medio (MGSM)7.
Protocol
Representative Results
Discussion
I requisiti specifici di O2 concentrazione di MTB li rendono banale a crescere in laboratorio. Un passaggio chiave del protocollo per mezzo liquido è la rimozione iniziale di tutti i O2 dal mezzo al fine di controllare la concentrazione finale aggiungendo un volume determinato di O2, appena prima dell’inoculazione. È stato dimostrato che MSR-1 cresce in condizioni aerobiche quasi completamente, tuttavia, il magnetismo delle cellule è drasticamente ridotto. I risultati dello stesso stud…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Richard B. Frankel per il suo aiuto con MTB culture, Adam P. Hitchcock e Xiaohui Zhu per il loro supporto durante la configurazione delle culture MTB presso la McMaster University e Marcia Reid per la formazione e l’accesso alla struttura di microscopia elettronica (McMaster University, Facoltà di Scienze della salute). Questo lavoro è stato supportato da scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) e la US National Science Foundation.
Materials
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 – 12 N |
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