Växande Magnetotactic bakterier av släktet Magnetospirillum: stammar MSR-1, AMB-1 och MS-1
Summary
Vi presenterar ett förfarande för att odla flera stammar av Magnetospirillum i två olika typer av tillväxtmassmedia. Magnetospirillum gryphiswaldense stam MSR-1 odlas i både flytande och O2 koncentrationsgradient halvfasta media medan M. magneticum stam AMB-1 och M. magnetotacticum stam MS-1 odlas i flytande medium.
Abstract
Magnetotactic bakterier är gramnegativa, rörliga, främst vattenlevande prokaryoter som är allestädes närvarande i sötvatten och marina livsmiljöer. De kännetecknas av sin förmåga att biomineralize magnetosomes, som är magnetiska nanometer stora kristaller av magnetit (Fe3O4) eller greigite (Fe3S4) omgiven av en lipid lipidens membran, inom deras cytoplasman. För de flesta kända magnetotactic bakterier monteras magnetosomes i kedjor inuti cytoplasman, därmed ger en permanent magnetiskt dipolmoment till cellerna och orsakar dem att anpassa passivt med externa magnetfält. På grund av dessa särdrag har magnetotactic bakterier en stor potential för kommersiella och medicinska tillämpningar. Men de flesta arter är microaerofil och har specifika O2 koncentration krav, vilket gör dem svårare att växa rutinmässigt än många andra bakterier som Escherichia coli. Här presenterar vi detaljerade protokoll för växande tre av de mest studerade stammarna av magnetotactic bakterier, alla som tillhör släktet Magnetospirillum. Dessa metoder möjliggör exakt kontroll av O2 koncentrationen görs tillgängliga för bakterier, för att säkerställa att de växa normalt och syntetisera magnetosomes. Växande magnetotactic bakterier för ytterligare studier med hjälp av dessa förfaranden kräver inte experimentalist vara expert i mikrobiologi. De allmänna metoder som presenteras i den här artikeln kan också användas för att isolera och kultur andra magnetotactic bakterier, även om det är sannolikt att tillväxt medier kemiska sammansättning kommer att behöva ändras.
Introduction
Magnetotactic bakterier (MTB) representerar ett brett utbud av gramnegativ prokaryoter allestädes närvarande i sötvatten och Marina akvatiska livsmiljöer1. Dessa bakterier dela förmågan att producera magnetiska kristaller av antingen magnetit (Fe3O4) eller greigite (Fe3S4), som har de flesta fall monteras till kedjor inuti cellerna. Detta särskilda strukturella motiv beror på närvaron av flera specifika proteiner som agerar både i cytoplasman av bakterier och på lipid membranet som omger varje kristall2. Varje enskild kristall och dess omgivande membran vesikler kallas en magnetosome och är varierar i storlek från ca 30 till 50 nm i Magnetospirillum Art3. På grund av kedjan ordningen av magnetosomes besitter dessa bakterier en permanent magnetiskt dipolmoment som gör dem justera passivt med anbringas utanpå magnetfält. Därför, dessa bakterier aktivt simma längs magnetiska fältlinjer, agerar som självgående mikro-kompasser förmodligen till mer effektivt lokalisera de mest gynnsamma villkor (t.ex., O2 koncentration) för tillväxt.
En intressant egenskap av MTB är deras förmåga att reglera både kemi och kristallografi av deras magnetosome kristaller. De flesta stammar producerar relativt hög renhet kristaller av antingen magnetit eller greigite, även om vissa biomineralize båda mineraler4. Bakterierna är i alla fall kunna kontrollera exakt storleken och formen på deras enda magnetiska domän kristaller. Detta förklarar varför en stor mängd forskning är åtagit sig att utveckla en bättre förståelse av hur MTB utföra proceduren biomineralization. Förstå denna process kan ge forskarna att skräddarsy magnetiska nanokristaller för många kommersiella och medicinska tillämpningar.
Ett betydande hinder för omfattande forskning på MTB har varit svårigheten att odla dem i laboratoriet. De flesta arter, inklusive de stammar som används i detta arbete är frövivlar namnet när vuxit med O2 som en terminal Elektronacceptor. Detta förklarar varför dessa bakterier finns oftast vid övergångszonen mellan genotoxisk och anoxiska förhållanden (oxic-anoxiska gränssnittet, OAI). Detta visar tydligt att MTB har exakt O2 koncentration krav som uppenbarligen behöver beaktas när utforma Odlingsmedier för dessa organismer. Dessutom innebär MTB befintliga mångfald att olika stammar kommer att behöva olika typer av kemiska gradienter och näringsämnen för att uppnå optimal tillväxt.
I detta arbete, beskriver vi metoderna för odling av tre av de mest studerade MTB: Magnetospirillum magneticum (stam AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) och M. gryphiswaldense (MSR-1). Dessa arter fylogenetiskt tillhör klassen Alphaproteobacteria i den Proteobacteria stammen, är spiralformade i morfologi och besitter en polar flagellen i varje ände av cellen. Vi tillhandahåller protokollen för växande stam MSR-1 i både flytande och O2 koncentrationsgradient halvfasta media, baserat på tidigare publicerade medelstora recept5,6. Vi presenterar också ett detaljerat protokoll för växande stammar AMB-1 och MS-1 i modifierade magnetiska Spirillum tillväxt Medium (MGSM)7.
Protocol
Representative Results
Discussion
De särskilda O2 koncentration kraven i MTB gör dem icke-trivialt att växa i laboratoriet. Ett viktigt steg för protokollet för flytande medium är inledande avlägsnande av alla O2 från medlet för att styra slutliga koncentration genom att lägga till en bestämd volym av O2, strax före inympning. Det har visat att MSR-1 växer under nästan helt aeroba förhållanden, dock är magnetism av cellerna är drastiskt. Resultaten från samma studie visade att stammar AMB-1 och MS-1 int…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Richard B. Frankel för hans hjälp med MTB kulturer, Adam P. Hitchcock Xiaohui Zhu för deras stöd medan inställningen upp MTB kulturer vid McMaster University och Marcia Reid för utbildning och tillträde till anläggningen elektronmikroskopi (McMaster University, Hälsouniversitetet). Detta arbete stöds av de naturliga vetenskaperna och Engineering Research rådet av Kanada (NSERC) och oss National Science Foundation.
Materials
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 – 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621 (2016).
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A ‘capillary racetrack’ method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
