في فيفو التعبير المستهدفة من البروتينات أوبتوجينيتيك باستخدام الأفلام الحرير/إف
Summary
وهنا نقدم طريقة لإيصال النواقل الفيروسية التعبير في الدماغ باستخدام الأفلام fibroin الحرير. هذا الأسلوب يسمح التنفيذ الهادف لناقلات التعبير باستخدام الألياف البصرية المغلفة بالحرير/إف ومدبب من الألياف الضوئية ونوافذ الجمجمة.
Abstract
السعي فهم كيف العصبية دوائر المعلومات العملية من أجل إخراج محرك الأقراص السلوكية قد ساعد إلى حد كبير بوسائل بصرية وضعت مؤخرا للتلاعب ورصد نشاط الخلايا العصبية في الجسم الحي. تعتمد هذه الأنواع من التجارب على عنصرين رئيسيين هما: 1) القابلة للغرس من الأجهزة التي توفر الوصول البصرية إلى الدماغ، والبروتينات 2) حساسة للضوء أن تغيير استثارة الخلايا العصبية أو تقديم قراءات لنشاط الخلايا العصبية. وهناك عدد من الطرق للتعبير عن البروتينات حساسة للضوء، ولكن الحقن ستيريوتاكسيك من النواقل الفيروسية حاليا النهج الأكثر مرونة لأنه يمكن التحكم في التعبير بدقة الوراثية والتشريحية والزمانية. على الرغم من فائدة كبيرة من النواقل الفيروسية، إيصال الفيروس إلى الموقع الذي يزرع الضوئية يطرح العديد من التحديات. حقن فيروس ستيريوتاكسيك يطالبون بالعمليات الجراحية التي زيادة وقت الجراحة، وزيادة تكلفة الدراسات، وتشكل خطرا على صحة الحيوان. يمكن أن تتلف الأنسجة المحيطة فعلياً بحقنه الحقن ومكسبه الالتهابات الناجمة عن تسليم المفاجئ بلعه فيروسات عالية-عيار. محاذاة الحقن مع يزرع الضوئية ومن الصعوبة عند استهداف المناطق الصغيرة في أعماق الدماغ. للتغلب على هذه التحديات، يمكننا وصف طريقة لطلاء أنواع متعددة من يزرع بصري مع الأفلام تتكون من الحرير fibroin ومتجهات (إف) الفيروسية المرتبطة بالغدة. يمكن تغليف بوليمر المستمدة من الشرنقة من موري بومباي، فيبروين، وحماية الجزيئات الحيوية ويمكن معالجتها في أشكال تتراوح بين الأفلام القابلة للذوبان للسيراميك. عند زرعها في الدماغ، الطلاء الحرير/إف الإفراج عن الفيروسات في مجال التفاعل بين العناصر البصرية والدماغ المحيطة بها، ويقود التعبير تحديداً حيث أنه مطلوب. هذا الأسلوب هو تنفيذها بسهولة ويبشر بأن ييسر إلى حد كبير في فيفو دراسات مهمة الدائرة العصبية.
Introduction
العقد الماضي أسفر انفجار هندسة البروتينات حساسة للضوء لرصد ومعالجة النشاط العصبي1. فيروسات توفر مرونة لا مثيل لها للتعبير عن هذه الأدوات أوبتوجينيتيك في المخ. وبالمقارنة بالحيوانات المحورة وراثيا، الفيروسات أسهل بكثير لإنتاج ونقل وتخزين والسماح بالتنفيذ السريع لأحدث أدوات أوبتوجينيتيك. يمكن استهداف التعبير وراثيا للسكان العصبية متميزة، والفيروسات المصممة لنقل إلى الوراء حتى يمكن أن تستخدم لاستهداف التعبير استناداً إلى اتصال الخلايا العصبية2.
عادة ما يتم إدخال الفيروسات مع حقن ستيريوتاكسيك، التي يمكن أن تكون صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. دقة استهداف المناطق الصغيرة يمكن أن تكون صعبة، بينما القيادة التعبير أكثر مجالات واسعة كثيرا ما يتطلب العديد من الحقن. وعلاوة على ذلك، عندما يكون جهاز بصري مزروع في وقت لاحق في الدماغ لتسليم الخفيفة في فيفو، عملية الزرع يجب أن تكون محاذاة بشكل صحيح مع حقن الفيروسية. هنا، يمكننا وصف أسلوب تنفيذها بسهولة عن تسليم ناقلات الأمراض الفيروسية للأنسجة حول جهاز مزروع باستخدام الحرير fibroin الأفلام3. فيبروين الحرير المتاحة تجارياً، ويتغاضى عنها جيدا بالانسجة العصبية، ويمكن استخدامها لإنتاج مواد ذات خصائص متنوعة. يمكن تطبيقها ليزرع باستخدام معدات المختبرات المشتركة مثل الماصات microinjection أفلام الحرير أو من ناحية الماصات. الأفلام الحرير/إف إلغاء شرط اثنين العمليات الجراحية والتأكد من أن الفيروس بوساطة التعبير بشكل صحيح محاذاة لزرع الضوئية. التعبير الناتج مقيد إلى غيض من الألياف، والنتائج في أقل تعبير غير المرغوب فيها على طول مسار الألياف من حقن ستيريوتاكسيك.
بالإضافة إلى إنتاج التعبير المستهدفة في غيض من ألياف صغيرة، يمكن استخدام أفلام الحرير/إف لحملة على نطاق واسع (> 3 مم) التعبير القشرية تحت windows الجمجمة. في فيفو التصوير 2-فوتون من أجهزة الاستشعار النشاط الفلورسنت أصبحت أداة لا غنى عنها لتقييم دور نشاط الخلايا العصبية في القيادة المعالجة الحسية والمعرفية. ومع ذلك، أداء التعبير على مناطق واسعة القشرية، المجربون في كثير من الأحيان لقيادة موحدة حقنات متعددة. هذه الحقن يمكن أن تستغرق وقتاً طويلاً جداً، ويمكن أن يؤدي إلى التعبير غير متناسقة عبر مجال الرؤية. وفي المقابل، الحرير/إف-المغلفة النوافذ الجمجمة سهلة للغاية صنع ويقلل كثيرا من الوقت اللازم للعمليات الجراحية، وآخر ملحوظ محرك التعبير مئات ميكرون تحت السطح القشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام الحرير/إف أن تستهدف التعبير عن البروتينات أوبتوجينتيك ويتغلب على القيود المفروضة على النهج التي قيد الاستخدام حاليا. على الرغم من أن العديد من الدراسات بنجاح استخدام حقن إف للتعبير عن البروتينات أوبتوجينيتيك، أنها تمثل تحديا لمحاذاة التعبير إلى غيض الألياف الضوئية وإلى المناطق …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر فاسكويز جيه للرسوم التوضيحية وكابلان دال وجيم بريدًا الكواشف وتوجيهات مفيدة، ومختبرات ساباتيني باء وجيم هارفي للتصوير في فيفو . الفحص المجهري وأمكن أوكانا م ومركز تصوير بيولوجيا الأعصاب، تدعمها جزئيا مركز التصوير العصبي كجزء من “الوطني المعهد من الاضطرابات العصبية” و “السكتة الدماغية” (NINDS) P30 الأساسية مركز منح (NS072030). وأيد هذا العمل من مؤسسة الأسرة خوداداد جبر، والمؤسسة، و “علامات لوري نانسي” بمنح المعاهد الوطنية للصحة، R21NS093498 نيندس، U01NS108177 و R35NS097284 نيندس إلى W.G.R، ومن المعاهد الوطنية للصحة ما بعد الدكتوراه زمالة F32NS101889 إلى C.H.C.
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
References
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Jackman, S. L., et al. Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins. Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (68), e50004 (2012).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (3), 194 (2007).
- Cao, Y., Wang, B. Biodegradation of silk biomaterials. International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).
- Hines, D. J., Kaplan, D. L. Mechanisms of controlled release from silk fibroin films. Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).
- Hu, X., et al. Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing. Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).
- Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation. Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).
- Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds. European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).
