In Vivo Gezielte Expression von optogenetische Proteinen mit Seide/AAV Filme
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode für die Bereitstellung von viralen Expressionsvektoren in das Gehirn mit Seide Fibroin Filme. Diese Methode ermöglicht die gezielte Bereitstellung von Expressionsvektoren mit beschichteten Glasfasern Seide/AAV, konische Lichtleitfasern und kranialen Fenster.
Abstract
Das Streben zu verstehen, wie neuronale Schaltkreise Prozessinformationen zu Verhaltensstörungen Antriebsleistung stark durch vor kurzem entwickelte optische Methoden zur Manipulation und Kontrolle der Tätigkeit der Neuronen in Vivounterstützt worden ist. Diese Art von Experimenten setzen auf zwei Hauptkomponenten: 1) implantierbare Geräte, die optischen Zugriff auf das Gehirn und (2) lichtempfindliche Proteine, die neuronale Erregbarkeit zu ändern oder eine Auslesen der neuronalen Aktivität. Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, lichtempfindliche Proteine auszudrücken, aber stereotaktischen Injektion von viralen Vektoren ist derzeit die flexibelste Ansatz, da Ausdruck mit genetischen, anatomische und zeitliche Präzision gesteuert werden kann. Trotz der großen Nutzen von viralen Vektoren liefert dem Virus auf der Website von optischen Implantate stellt zahlreiche Herausforderungen. Stereotaktischen Virus-Injektionen fordern Operationen, die OP-Dauer zu erhöhen, erhöhen die Kosten des Studiums und eine Gefahr für die Gesundheit des Tieres. Das umliegende Gewebe kann körperlich durch die Injektionsspritze und immunogen Entzündung verursacht durch die abrupte Lieferung eines Bolus von hoher Titer Virus beschädigt werden. Ausrichten von Injektionen mit optischen Implantate ist besonders schwierig, wenn Sie auf kleine Regionen tief im Gehirn. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, beschreiben wir eine Methode zur Beschichtung von mehreren Arten von optischen Implantate mit Filmen aus Seide Fibroin und Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren. Fibroin, ein Polymer, abgeleitet aus dem Kokon der Bombyx Mori, kann Kapseln schützen Biomoleküle und kann in Form von löslichen Filme bis hin zu Keramik verarbeitet werden. Seide/AAV Beschichtungen lassen, wenn in das Gehirn implantiert, Virus an der Schnittstelle zwischen optischen Elementen und dem umliegenden Gehirn fahren Ausdruck genau da, wo es gebraucht wird. Diese Methode ist leicht umgesetzt und verspricht, in Vivo Studien der neuralen Schaltkreis-Funktion erheblich erleichtern.
Introduction
Im vergangene Jahrzehnt hat eine Explosion von veränderter lichtempfindliche Proteine für die Überwachung und Manipulation neuronale Aktivität1produziert. Viren bieten unvergleichlichen Flexibilität für den Ausdruck dieser optogenetische Werkzeuge im Gehirn. Im Vergleich zu transgenen Tieren, sind Viren viel einfacher zu produzieren, zu transportieren und zu speichern, ermöglicht die schnelle Umsetzung der neuesten optogenetische Werkzeuge. Ausdruck kann auf unterschiedlichen neuronalen Populationen genetisch ausgerichtet sein, und Viren entwickelt für die retrograder Transport können auch Ausdruck basiert auf neuronalen Verbindungen2Ziel verwendet werden.
Viren sind in der Regel mit stereotaktischen Injektionen eingeführt, die zeitaufwändig und anspruchsvoll sein können. Präzise Ausrichtung auf kleine Regionen kann schwierig sein, während Ausdruck oft über weite Bereiche fahren viele Injektionen erfordert. Außerdem, wenn ein optisches Gerät anschließend in das Gehirn, um Licht in Vivoliefern implantiert ist, muss das Implantat richtig mit der viralen Injektion ausgerichtet sein. Hier beschreiben wir eine leicht implementiert Methode für die Bereitstellung von viraler Vektoren des Gewebes um eine implantierte Gerät mit Seide Fibroin Filme3. Seide Fibroin ist im Handel erhältlich, gut verträglich durch neuronale Gewebe und kann verwendet werden, um Materialien mit unterschiedlichen Eigenschaften zu produzieren. Seide Filme können auch auf Implantate mit gemeinsamen Laborgeräte wie Mikroinjektion Pipetten oder hand Pipetten. Seide/AAV Filme beseitigen die Forderung nach zwei chirurgische Eingriffe und sicherzustellen, dass Virus-vermittelten Expression mit dem optischen Implantat richtig ausgerichtet ist. Der resultierende Ausdruck wird auf die Spitze der Fasern und führt zu weniger unerwünschten Ausdruck entlang der Faser-Strecke als stereotaktischen Injektionen beschränkt.
Neben der Produktion von gezielten Ausdruck an der Spitze der kleinen Fasern, Seide/AAV Filme können verwendet werden, um weit verbreitete fahren (> 3 mm Durchmesser) kortikale Ausdruck unter kranialen Fenster. In Vivo 2-Photonen-Bildgebung von fluoreszierenden Bewegungssensoren ist ein unverzichtbares Instrument für die Bewertung der Rolle der neuronalen Aktivität im sensorischen und kognitiven Verarbeitung fahren geworden. Jedoch um einheitliche fahren Ausdruck über die kortikalen Bereichen Experimentatoren häufig mehrere Injektionen durchführen. Diese Injektionen können sehr zeitaufwändig sein und können zu inkonsistenten Ausdruck in das Sichtfeld führen. Im Gegensatz dazu sind Seide/AAV-beschichtete kranialen Fenster extrem einfach zu fertigen, erheblich reduzieren den Zeitaufwand für Operationen und fahren am bemerkenswertesten Ausdruck Hunderte von µm unterhalb der kortikalen Oberfläche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von Seide/AAV, die Expression von Optogentic Proteinen Ziel überwindet Grenzen von Ansätzen, die derzeit im Einsatz sind. Obwohl viele Studien erfolgreich AAV Injektionen verwenden optogenetische Proteine zum Ausdruck zu bringen, ist es schwierig, Ausdruck bis zur Spitze von optischen Fasern, Regionen rund um die Länge der konischen Fasern und ein Grinsen Objektiv betrachten und Umgebung auszurichten. Wegen der Fehlstellung zwischen optischer Komponenten und optogenetische Ausdruck stereotaktischen Inje…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren wollen J. Vazquez für Illustrationen, D. Kaplan und C. Preda für Reagenzien und hilfreiche Hinweise und den Labors von B. Sabatini und C. Harvey für in-Vivo Bildgebung zu danken. Mikroskopie wurde ermöglicht durch M. Ocana und Neurobiologie Imaging Center, teilweise unterstützt durch die neuralen Imaging Center als Teil einer National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall (NINDS) P30 Kernzentrum gewähren (NS072030). Diese Arbeit wurde durch die GVR Khodadad Familienstiftung, die Nancy Lurie Marks Foundation und NIH-Stipendien, NINDS R21NS093498, U01NS108177 und NINDS R35NS097284, W.G.R, und ein NIH postdoctoral Fellowship F32NS101889, C.H.C. unterstützt.
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
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