En Vivo Específica la expresión de proteínas de Optogenetic usando películas de seda/AAV
Summary
Aquí, presentamos un método de distribución de vectores de la expresión viral en el cerebro utilizando películas de fibroína de seda. Este método permite entrega dirigida de vectores de expresión utilizando fibras ópticas recubiertas de seda/AAV, ahusado de las fibras ópticas y ventanas craneales.
Abstract
La búsqueda para entender cómo neuronales circuitos de información del proceso en orden de salida del variador comportamiento ha sido grandemente ayudado por métodos ópticos recientemente desarrollado para la manipulación y seguimiento de la actividad de las neuronas in vivo. Estos tipos de experimentos se basan en dos componentes principales: 1) los implantables que proporcionan acceso óptico hacia el cerebro y las proteínas 2) sensible a la luz que cambian la excitabilidad neuronal o proporcionan una lectura de la actividad neuronal. Hay un número de maneras de expresar proteínas sensibles a la luz, pero la inyección estereotáctica de vectores virales es actualmente el enfoque más flexible porque la expresión puede ser controlada con precisión genética, anatómica y temporal. A pesar de la gran utilidad de vectores virales, entregando el virus en el sitio de implantes ópticos plantea numerosos retos. Las inyecciones estereotáxicas virus exigen cirugías que aumentan el tiempo quirúrgico, aumentan el costo de los estudios y suponen un riesgo para la salud del animal. El tejido circundante puede ser físicamente dañado por la jeringuilla de inyección y por inmunogénica inflamación causada por la abrupta entrega de un bolo de virus de alto título. Alineando las inyecciones con implantes ópticas es especialmente difícil cuando pequeñas regiones en el cerebro. Para superar estos retos, se describe un método para el revestimiento de varios tipos de implantes ópticos con películas compuestas de fibroína de seda y vectores (AAV) virales Adeno-asociado. La fibroína, un polímero derivado del capullo del Bombyx mori, puede encapsular y proteger biomoléculas y se puede procesar en formas que van desde películas solubles a la cerámica. Cuando se implanta en el cerebro, capas de seda/AAV liberan virus en la interfase entre elementos ópticos y el cerebro circundante, conduce expresión precisamente donde se necesita. Este método se implementa fácilmente y se compromete a facilitar mucho en vivo los estudios de la función neuronal del circuito.
Introduction
La última década ha producido una explosión de ingeniería proteínas sensibles a la luz para el monitoreo y manipulación de la actividad neural1. Virus ofrecen una flexibilidad sin precedentes para expresar estas herramientas de optogenetic en el cerebro. En comparación con animales transgénicos, los virus son mucho más fáciles de producir, transportar y almacenar, permitiendo la rápida implementación de las nuevas herramientas de optogenetic. Expresión puede ser dirigida genéticamente a distintas poblaciones neuronales y virus diseñados para el transporte retrógrado incluso pueden ser utilizados para orientar la expresión basada en la conectividad neuronal2.
Virus se introducen generalmente con inyecciones estereotáxicas, que pueden ser largo y difícil. Dirigidos precisamente a pequeñas regiones puede ser difícil, mientras que la expresión que conduce sobre grandes áreas a menudo requiere muchas inyecciones. Por otra parte, cuando un dispositivo óptico es posteriormente implantado en el cerebro para entregar luz en vivo, el implante debe estar correctamente alineado con la inyección viral. Aquí, describimos un método fácilmente implementados para la entrega de vectores virales en el tejido alrededor de un dispositivo implantado con fibroína seda películas3. Fibroína de seda está disponible en el mercado, bien tolerado por los tejidos neuronales y puede ser utilizada para producir materiales con propiedades variadas. Películas seda pueden aplicarse a implantes usando equipo de laboratorio común como microinyección pipetas o pipetas de la mano. Películas de seda/AAV eliminan el requisito de dos procedimientos quirúrgicos y aseguran de que la expresión mediada por virus es correctamente alineada al implante óptico. La expresión resultante está limitada a la punta de las fibras y los resultados en menos expresión no deseado a lo largo de la pista de fibra que las inyecciones estereotáxicas.
Además de producir la expresión específica en la punta de pequeñas fibras, películas de seda/AAV pueden utilizarse para conducir generalizada (> 3 mm de diámetro) expresión cortical bajo ventanas craneales. En vivo 2-fotón proyección de imagen de sensores fluorescentes de la actividad se ha convertido en una herramienta indispensable para evaluar el papel de la actividad neuronal en la conducción de procesamiento sensorial y cognitivo. Sin embargo, para conducir uniforme expresión sobre las grandes áreas corticales, experimentadores a menudo realizar inyecciones múltiples. Estas inyecciones pueden ser extremadamente desperdiciador de tiempo y pueden llevar a la expresión incoherente en el campo de visión. En cambio, seda/AAV-revestimiento ventanas craneales son extremadamente fáciles de fabricar, reducir considerablemente el tiempo necesario para las cirugías y conducir más notable expresión cientos de micras por debajo de la superficie cortical.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de la seda/AAV a la expresión de proteínas optogentic supera limitaciones de los enfoques que están actualmente en uso. Aunque muchos estudios utilizan inyecciones de AAV para expresar proteínas de optogenetic, es un reto para alinear la expresión hasta la punta de las fibras ópticas, a regiones alrededor de la longitud de las fibras cónicas y a la región de la visión de una lente GRIN. Debido a desalineamiento entre componentes ópticos y optogenetic expresión, inyecciones estereotáxicas pueden ser no …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a J. Vazquez para ilustraciones, Kaplan D. y C. Preda reactivos y orientación útil y los laboratorios de Sabatini B. y C. Harvey para la proyección de imagen en vivo . Microscopía fue hecha posible por M. Ocaña y el centro de la proyección de imagen de Neurobiología, apoyado en parte por el centro Neural de la imagen como parte de un Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y Stroke (NINDS) P30 núcleo centro concede (NS072030). Este trabajo fue financiado por el GVR Khodadad Family foundation, la Fundación de Nancy Lurie marcas y por subvenciones de NIH, NINDS R21NS093498, U01NS108177 y R35NS097284 de NINDS de W.G.R y por una beca postdoctoral de la NIH F32NS101889 a C.H.C.
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
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