生体内でシルク/AAV 膜を用いた光遺伝学的タンパク質の発現
Summary
絹フィブロイン膜を用いた脳にウイルス発現ベクターを配信する方法を紹介します。このメソッドは、シルク/AAV 被覆光ファイバー、光ファイバー、・頭蓋の windows を使用しての表現のベクトルのターゲットを絞った配信できます。
Abstract
順番にドライブ行動出力のプロセス情報を大きく操作およびニューロンの生体内の活動を監視するための光学的手法の最近開発されたに助けられたがどのように神経回路を理解するクエスト。これらの種類の実験の 2 つの主要なコンポーネントに頼る: 脳に光アクセスを提供する 1) 植込み型デバイスと神経活動の読み出しを提供したり神経細胞の興奮を変更 2) 光感応蛋白質。光感応蛋白質を表現する方法の数がありますが、式は、遺伝的、解剖学的、および時間の精度で制御できるためウイルスのベクトルの脳定位固定装置の注入は現在最も柔軟なアプローチ。ウイルスのベクトルの偉大なユーティリティ、にもかかわらず光インプラント ポーズのサイトに多くの課題にウイルスを提供します。定位ウイルス注射手術手術時間を高め、研究のコストは増大し動物の健康に危険をもたらす要求しています。注射器、高力価ウイルスの塊の突然の配信によって引き起こされる免疫原性炎症、周囲の組織を物理的に損傷することができます。小地域をターゲットにする場合の光インプラントと注射の整列は特に難しい脳の深い。これらの課題を克服するために、絹フィブロインとアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターから成るフィルムと光学インプラントの複数種類をコーティングする方法をについて説明します。フィブロイン、カイコ、繭由来のポリマーをカプセル化でき、生体分子を保護、水溶性フィルムからセラミックスに至るまでの形態に処理することができます。脳に注入、シルク/AAV コーティングは運転式が必要な場所に正確に光学素子と周囲の脳との間のインターフェイスでウイルスをリリースします。このメソッドは、簡単に実装し、大きく生体内神経回路機能の研究を促進することを約束します。
Introduction
過去 10 年間は、監視および神経活動1を操作するために設計された光に敏感な蛋白質の爆発を生産しています。ウイルスは、脳のこれらの光遺伝学的ツールを表現するための比類のない柔軟性を提供しています。トランスジェニック動物と比較して、ウイルスが生成し、輸送、保管、最新の光遺伝学的ツールの高速実装を許可するはるかに簡単。式は異なる神経細胞の集団を遺伝的対象とすることができます、逆行の輸送用に設計されたウイルスは神経接続2に基づいた式を対象にも使用できます。
ウイルスは通常時間がかかり、困難なことができる定位注射で紹介しています。小領域を正確にターゲットは、多くの注射が必要ですが幅広い分野に式を頻繁運転困難。また、光デバイス、光生体内で提供する脳に植えられたその後ウイルス注入で、インプラントを正しく配置する必要があります。ここでは、絹フィブロイン膜3を使用して注入デバイス周りの組織にウイルスのベクトルを提供するための簡単に実装手法について述べる。絹フィブロインは市販、神経組織をよく容認を様々 な特性を持つ素材を生成する使用ことができます。絹フィルム マイクロインジェクション ピペットのような一般的な検査機器を使用してインプラントに適用することができます。 またはピペットを手します。シルク/AAV フィルム 2 つの外科プロシージャのための要件を排除し、ウイルスによる発現は光のインプラントに正しく配置されていることを確認します。結果の式は、繊維と定位注射よりも繊維のトラックに沿って以下の不要な式の結果の先端に制限されます。
小さな繊維の先端に対象式に加え、シルク/AAV 映画を広範なドライブを使用できます (> 直径 3 mm) 頭蓋窓下に皮質表現。センサー蛍光活動 2 光子励起イメージング体内運転感覚と認知処理における神経活動の役割を評価するため不可欠なツールとなっています。しかし、制服を運転する多くの実験者の広範な皮質上式で複数の注射を実行します。これらの注射は非常に時間がかかることができ、ビューのフィールド間で一貫性のない表現につながることができます。対照的に、頭蓋 windows のシルク/AAV コーティングが製造し、手術に必要な時間を大幅に削減、最も著しくドライブ式数百ミクロン皮質表面の下の非常に簡単です。
Protocol
Representative Results
Discussion
シルク/AAV の optogentic 蛋白質の表現を対象とするは、現在使用しているアプローチの限界を克服します。多くの研究は、正常に光遺伝学的蛋白質を表現する AAV 注射を使用して、式光ファイバーの先端にテーパーの繊維の長さの周りの地域に、GRIN レンズの表示領域に合わせて挑戦です。光学部品、光式芯ズレ、ため定位注射が信頼性の高い、することができ、多くの実験は失敗します。ここ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者試薬と有用なガイダンス、および生体内イメージングのサバティーニ B. と c. ハーヴェイのラボ イラスト j. バスケス、d. カプラン、C. オイゲンプレダを感謝したいです。M. Ocana ・一部、国立研究所の神経疾患として神経イメージング研究センター部分で支え神経イメージング センターによって可能になった顕微鏡とストローク (NINDS) P30 コア センター (NS072030) を与えます。この仕事を受けました GVR 帰れない家族財団、ナンシー Lurie マーク財団と NIH の補助金、NINDS R21NS093498、U01NS108177、W.G.R に組織プラスミノーゲンアクテベータ R35NS097284、F32NS101889 C.H.C. に NIH ポスドク研究員プログラム
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
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