In Vivo Ciblé d’Expression des protéines Optogenetic, soie/AAV Films
Summary
Nous présentons ici une méthode pour délivrer des vecteurs d’expression virale dans le cerveau en utilisant des films de la fibroïne de soie. Cette méthode permet l’administration ciblée des vecteurs d’expression à l’aide de fibres optiques revêtues de soie/AAV, des fibres optiques effilés et windows crâniennes.
Abstract
La quête pour comprendre comment neurales circuits informations de processus afin de sortie comportementale en voiture a été grandement favorisées par récemment mis au point des méthodes optiques permettant la manipulation et le contrôle de l’activité des neurones in vivo. Ces types d’expériences s’appuient sur deux éléments principaux : 1) les implants qui fournissent l’accès optique vers le cerveau et les protéines 2) sensible à la lumière qui changent l’excitabilité neuronale ou fournissent une lecture de l’activité neuronale. Il y a plusieurs façons d’exprimer les protéines sensibles à la lumière, mais injection stéréotaxique de vecteurs viraux est actuellement l’approche plus souple parce que l’expression peut être contrôlée avec précision temporelle, anatomique et génétique. Malgré la grande utilité de vecteurs viraux, livrant le virus sur le site de poses d’implants optique relever de nombreux défis. Des injections de virus stéréotaxiques réclament des chirurgies qui augmentent le temps chirurgical, augmentent le coût des études et posent un risque pour la santé de l’animal. Les tissus avoisinants peuvent être physiquement endommagés par la seringue d’injection et immunogène inflammation provoquée par la brusque remise d’un bolus de haut-titre virus. Injections d’implants optiques d’alignement sont particulièrement difficile lorsque vous ciblez des petites régions profondément dans le cerveau. Pour surmonter ces défis, nous décrire un procédé de revêtement plusieurs types d’implants optiques avec films composés de soie fibroïne et adéno-associés des vecteurs viraux (AAV). Fibroïne, un polymère dérivé du cocon du Bombyx mori, peut encapsuler et protéger des biomolécules et peuvent être transformés en formes allant des films hydrosolubles à la céramique. Lorsqu’elles sont implantées dans le cerveau, soie/AAV revêtements libèrent des virus à l’interface entre les éléments d’optique et cerveau environnant, conduite expression précisément là où elle est nécessaire. Cette méthode est facilement mis en œuvre et promet de faciliter grandement les études in vivo de la fonction des circuits neuronaux.
Introduction
La dernière décennie a produit une explosion d’ingénierie protéines sensibles à la lumière pour la surveillance et de manipuler l’activité neurale1. Virus offrent une flexibilité inégalée pour exprimer ces outils d’optogenetic dans le cerveau. Par rapport aux animaux transgéniques, les virus sont beaucoup plus faciles à produire, transporter et stocker, permettant une mise en œuvre rapide des plus récents outils d’optogenetic. Expression peut être ciblée génétiquement à des populations neuronales distinctes et virus conçus pour le transport rétrograde peuvent même être utilisés pour cibler l’expression fondée sur la connectivité neuronale2.
Les virus sont généralement introduits avec injections stéréotaxiques, qui peuvent être long et difficile. Visant précisément les petites régions peut être difficile, alors que l’expression de conduite sur les grands domaines souvent nécessite plusieurs injections. En outre, lorsqu’un dispositif optique est ensuite implanté dans le cerveau de livrer léger en vivo, l’implant doit être parfaitement aligné avec l’injection virale. Nous décrivons ici une méthode facilement mises en œuvre pour livrer des vecteurs viraux dans les tissus autour d’un implant à l’aide de soie fibroïne films3. Soie fibroïne est disponible dans le commerce, bien tolérée par les tissus nerveux et peut être utilisé pour produire des matériaux aux propriétés variées. Films en soie peuvent être appliquées aux implants à l’aide d’équipement de laboratoire commun comme les pipettes de micro-injection ou pipettes à la main. Films de soie/AAV éliminent le besoin pour les deux procédures chirurgicales et faire en sorte que l’expression induite par le virus est correctement alignée à l’implant optique. L’expression résultante est contraint à l’extrémité des fibres et des résultats moins expression indésirables le long de la piste de fibre que les injections stéréotaxiques.
En plus de produire une expression ciblée à l’extrémité des petites fibres, soie/AAV films peuvent être utilisés pour piloter généralisée (> 3 mm de diamètre) expression corticale sous fenêtres crâniennes. De l’imagerie in vivo 2 photons de sondes fluorescentes activité est devenu un outil indispensable pour l’évaluation du rôle de l’activité neuronale dans la conduite de traitement sensoriel et cognitif. En revanche, pour conduire uniforme expression sur les grandes aires corticales, expérimentateurs souvent effectuer multi-injections. Ces injections peuvent être extrêmement longues et peuvent conduire à l’expression incompatible à travers le champ de vision. En revanche, soie/AAV-enduit crâniennes windows sont extrêmement faciles à fabriquer, de réduire considérablement le temps nécessaire pour les interventions chirurgicales et conduire plus remarquable expression des centaines de micromètres au-dessous de la surface corticale.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilisation de la soie/AAV pour cibler l’expression des protéines optogentic surmonte les limites des approches qui sont actuellement en cours d’utilisation. Bien que de nombreuses études utilisent avec succès les injections AAV pour exprimer les protéines optogenetic, il est difficile d’aligner l’expression jusqu’à l’extrémité des fibres optiques, aux régions autour de la longueur des fibres coniques et à la région regarde un d’une lentille de sourire. À cause de défaut d’alignement entre l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier J. Vazquez pour illustrations, d. Kaplan et Preda C. réactifs et indications utiles aux laboratoires de Sabatini B. et C. Harvey pour l’imagerie in vivo . Microscope a été rendue possible par M. Ocana et le centre de formation image de neurobiologie, financée en partie par le centre d’imagerie neurale dans le cadre d’un National Institute of Neurological Disorders et accorder des Stroke (NINDS) P30 Core Center (NS072030). Ce travail a été soutenu par la GVR Khodadad Family foundation, la Fondation Nancy Lurie marques et par des subventions des NIH, NINDS R21NS093498, U01NS108177 et R35NS097284 de NINDS à W.G.R et par une bourse postdoctorale du NIH F32NS101889 à C.H.C.
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
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