В естественных условиях Целевые выражение Optogenetic белков с помощью шелка/AAV фильмы
Summary
Здесь мы представляем метод доставки векторы экспрессии вирусных в мозга с помощью пленки Фиброин шелка. Этот метод позволяет адресности векторы выражения с использованием шелка/AAV покрытием оптического волокна, коническая оптических волокон и черепной windows.
Abstract
Стремление понять как нейронных цепей, обрабатывать информацию в целях поведенческих мощность привода значительно способствовало недавно разработанных оптических методов для манипулирования и мониторинга активности нейронов в естественных условиях. Эти типы экспериментов полагаться на двух основных компонентов: 1) имплантируемых устройств, которые обеспечивают оптический доступ к мозгу и 2) светочувствительные белки, которые изменить возбудимости нейронов или предоставить индикация активности нейронов. Существует ряд способов выразить светочувствительные белков, но стереотаксического инъекции вирусных векторов в настоящее время наиболее гибкий подход, потому что выражение может управляться с точностью, генетические, анатомические и временных. Несмотря на большую полезность вирусных векторов доставлять вирус на сайт оптических имплантатов создает многочисленные проблемы. Стереотаксическая вирусом инъекции требуют хирургических операций, которые увеличивают время хирургических, увеличить стоимость исследований и представляют опасность для здоровья животных. Окружающие ткани могут быть физически повреждены путем инъекций шприц и иммуногенные воспаления, вызванного резким доставки болюс высокий титр вируса. Выравнивание инъекции с оптическим имплантаты особенно трудно, при таргетинге малых регионов глубоко в головном мозге. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы описываем метод для покрытия различных типов оптических имплантатов с фильмов состоит из Фиброин шелка и аденоассоциированный вирусных векторов (AAV). Фиброин, полимер производный из кокона Тутовый шелкопряд, может инкапсулировать и защищать биомолекул и могут быть обработаны в формах, начиная от растворимых фильмов для керамики. При имплантированных в мозг, шелк/AAV покрытия выпустить вирус на стыке оптических элементов и окружающих мозг, вождение выражение точно, где она необходима. Этот метод легко реализуется и обещает значительно облегчить в vivo исследования нейронной цепи функции.
Introduction
За последнее десятилетие подготовил взрыв инженерии светочувствительные белков для мониторинга и манипулирования нейронной активности1. Вирусы предлагают непревзойденную гибкость для выражения этих инструментов optogenetic в мозге. По сравнению с трансгенных животных, вирусы являются гораздо проще для производства, транспортировки и хранения, что позволяет быстрое внедрение новейших инструментов optogenetic. Выражение может быть выполнено генетически различных нейрональных популяций, и вирусы, предназначенные для ретроградного транспорта может использоваться даже для выражения на базе нейрональных подключения2.
Вирусы обычно вводятся с стереотаксического инъекции, которые может быть длительным и сложным. Именно против малых регионов может быть трудно, в то время как вождение выражение более широких областей часто требует много инъекции. Кроме того когда оптическое устройство впоследствии имплантированных в мозг, чтобы доставить свет в естественных условиях, имплантат должен быть должным образом выровнен с вирусной инъекции. Здесь мы описываем легко реализован метод доставки вирусных векторов в ткани вокруг имплантированного устройства использование Фиброин шелка фильмы3. Фиброин шелка коммерчески доступных, хорошо переносится нервных тканей и может использоваться для производства материалов с разнообразными свойствами. Шелковые фильмы могут быть применены к имплантатов с использованием общего лабораторного оборудования как микроинъекции пипетки или ручной пипетки. Шелк/AAV фильмы устранить требование о двух хирургических процедур и убедитесь, что вирус опосредованной выражение должным образом выравнивается оптический имплант. Результирующее выражение ограничивается кончик волокон и результаты в менее нежелательных выражение вдоль волокна трек чем стереотаксического инъекции.
В дополнение к производству целевых выражение на кончике мелких волокон, шелк/AAV пленки могут использоваться для привода широко (> 3 мм диаметром) корковых выражение под черепной windows. В естественных условиях 2-Фотон изображений датчиков флуоресцентные деятельность стала незаменимым инструментом для оценки роли нейронной активности в автошколах чувств и когнитивной обработки. Однако диск единообразных выражение более широких областей коры головного мозга, экспериментаторы часто выполняют множественные инъекции. Эти инъекции может быть очень много времени и может привести к несовместимым выражение через поле зрения. В отличие от этого шелк/AAV-покрытием черепной окна являются очень легко производить, значительно сократить время, необходимое для операции, и наиболее удивительно выражение сотен микрон ниже поверхности коры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование шелк/AAV для выражения optogentic белков преодолевает ограничения подходов, которые в настоящее время используются. Хотя многие исследования успешно использовать AAV инъекции, чтобы выразить optogenetic белков, это сложно выровнять выражение кончик оптических волокон, регионы вокру…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить J. Васкес для иллюстрации, D. Каплан и C. ПРЕДА для реагентов и полезные рекомендации и в лабораториях B. Сабатини и C. Харви для изображений в естественных условиях . Микроскопия стало возможным M. Ocana и центром визуализации нейробиологии, частично поддержаны центр томографии нейронные как часть Национальный институт неврологических расстройств и инсульта (NINDS) P30 основной центр Грант (NS072030). Эта работа была поддержана путем фонд GVR Ходадад семьи, Нэнси Лурье знаки и низ грантов, NINDS R21NS093498, U01NS108177 и NINDS R35NS097284 для W.G.R и низ докторской стипендии F32NS101889 C.H.C.
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
References
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Jackman, S. L., et al. Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins. Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (68), e50004 (2012).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (3), 194 (2007).
- Cao, Y., Wang, B. Biodegradation of silk biomaterials. International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).
- Hines, D. J., Kaplan, D. L. Mechanisms of controlled release from silk fibroin films. Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).
- Hu, X., et al. Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing. Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).
- Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation. Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).
- Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds. European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).
