Évaluation rapide de la toxicité des composés chimiques à l'aide d'embryons de poisson zèbre
Summary
Les embryons de poissons zèbres sont utilisés pour évaluer la toxicité des composés chimiques. Ils se développent à l’extérieur et sont sensibles aux produits chimiques, permettant la détection de changements phénotypiques subtils. L’expérience ne nécessite qu’une petite quantité de composé, qui est directement ajouté à la plaque contenant des embryons, ce qui rend le système de test efficace et rentable.
Abstract
Le poisson zèbre est un organisme modèle vertébré largement utilisé pour la découverte de médicaments à base de phénotypes. Le poisson zèbre génère de nombreuses descendantes, a des embryons transparents et un développement externe rapide. Les embryons de poissons zèbres peuvent donc également être utilisés pour l’évaluation rapide de la toxicité des médicaments qui sont précieux et disponibles en petites quantités. Dans le présent article, une méthode pour le criblage efficace de la toxicité des composés chimiques utilisant des embryons de 1-5 jours après la fertilisation est décrite. Les embryons sont surveillés par stéréomicroscope pour étudier les défauts phénotypiques causés par l’exposition à différentes concentrations de composés. Des concentrations létales semi-maximales (LC50) des composés sont également déterminées. La présente étude a exigé 3-6 mg d’un composé d’inhibiteur, et l’ensemble de l’expérience prend environ 8-10 h pour être accompli par un individu dans un laboratoire ayant des équipements de base. Le protocole actuel est approprié pour tester n’importe quel composé afin d’identifier les effets toxiques ou hors cible intolérables du composé dans la phase initiale de la découverte de médicaments et de détecter les effets toxiques subtils qui peuvent être manqués dans la culture cellulaire ou d’autres modèles animaux. La méthode réduit les retards procéduraux et les coûts de développement des médicaments.
Introduction
Le développement de médicaments est un processus coûteux. Avant qu’un seul composé chimique ne soit approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) et l’Agence européenne des médicaments (EMA), plusieurs milliers de composés sont examinés à un coût de plus d’un milliard de dollars1. Pendant le développement préclinique, la plus grande partie de ce coût est nécessaire pour l’expérimentation animale2. Pour limiter les coûts, les chercheurs dans le domaine du développement de médicaments ont besoin de modèles alternatifs pour le dépistage de l’innocuité des composés chimiques3. Par conséquent, dans la phase initiale du développement du médicament, il serait très bénéfique d’utiliser une méthode qui peut rapidement évaluer l’innocuité et la toxicité des composés dans un modèle approprié. Il existe plusieurs protocoles qui ont été utilisés pour le dépistage de la toxicité des composés chimiques impliquant des modèles de culture animale et cellulaire, mais il n’y a pas un seul protocole qui est validé et est en usage courant4,5. Les protocoles existants utilisant le poisson zèbre varient en longueur et ont été utilisés par des chercheurs individuels qui ont évalué la toxicité selon leur exigence de commodité6,7,8,9, 10 Ans et plus , 11 Ans, états-unis ( , 12.
Dans un passé récent, le poisson zèbre est apparu comme un modèle pratique pour l’évaluation de la toxicité des composés chimiques au cours du développement embryonnaire6,7. Le poisson zèbre a de nombreux avantages intégrés pour l’évaluation des composés chimiques13. Même les expériences à grande échelle sont favorables, car une femelle poisson zèbre peut pondre des lots de 200-300 œufs, qui se développent rapidement ex vivo, n’ont pas besoin d’alimentation externe pour un pas jusqu’à une semaine et sont transparents. Les composés peuvent être ajoutés directement dans l’eau, où ils peuvent (selon la nature du composé) diffuser à travers le chorion, et après l’éclosion, à travers la peau, les branchies et la bouche des larves. Les expériences ne nécessitent pas de quantités abondantes de composés chimiques14 en raison de la petite taille de l’embryon. Le développement d’embryons de poisson zèbre exprime la plupart des protéines nécessaires pour atteindre les résultats normaux du développement. Par conséquent, un embryon de poisson zèbre est un modèle sensible pour évaluer si un médicament potentiel peut perturber la fonction d’une protéine ou d’une molécule de signalisation qui est significative sur le plan du développement. Les organes du poisson zèbre deviennent fonctionnels entre 2-5 dpf15, et les composés qui sont toxiques pendant cette période sensible de développement embryonnaire induisent des défauts phénotypiques chez les larves de poissons zèbres. Ces changements phénotypiques peuvent être facilement détectés à l’aide d’un simple microscope sans techniques invasives11. Les embryons de poissons zèbres sont largement utilisés dans la recherche toxicologique en raison de leur complexité biologique beaucoup plus grande par rapport au dépistage in vitro des médicaments à l’aide de modèles de culture cellulaire16,17. En tant que vertébré, la composition génétique et physiologique du poisson zèbre est comparable à l’homme et donc les toxicités des composés chimiques sont similaires entre le poisson zèbre et l’homme8,18,19, 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22. Le poisson zèbre est donc un outil précieux dans la phase initiale de la découverte de médicaments pour l’évaluation de la toxicité et de la sécurité des composés chimiques.
Dans le présent article, nous fournissons une description détaillée de la méthode utilisée pour évaluer l’innocuité et la toxicité des composés inhibiteurs de l’anhydrase carbonique (CA) à l’aide d’embryons de poisson zèbre post-fertilisation (dpf) de 1 à 5 jours par un seul chercheur. Le protocole consiste à exposer les embryons de poissons zèbres à différentes concentrations de composés inhibiteurs chimiques et à étudier la mortalité et les changements phénotypiques au cours du développement embryonnaire. À la fin de l’exposition aux composés chimiques, la dose lc50 du produit chimique est déterminée. La méthode permet à une personne d’effectuer un dépistage efficace de 1-5 composés d’essai et prend environ 8-10 h en fonction de l’expérience de la personne avec la méthode (Figure 1). Chacune des étapes requises pour évaluer la toxicité des composés est décrite à la figure 2. L’évaluation de la toxicité des inhibiteurs de l’AC nécessite 8 jours, et comprend la mise en place de paires d’accouplement (jour 1); la collecte des embryons dans les réservoirs de reproduction, leur nettoyage et leur transfert dans un incubateur de 28,5 oC (jour 2); la distribution des embryons dans les puits d’une plaque de 24 puits et l’ajout de composés inhibiteurs dilués de l’AC (jour 3); l’analyse phénotypique et l’imagerie des larves (jour 4-8), et la détermination de la dose de LC50 (jour8). Cette méthode est rapide et efficace, nécessite une petite quantité du composé chimique et seulement des installations de base du laboratoire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le test de toxicité in vitro à l’aide de cellules cultivées peut détecter la survie et les études morphologiques des cellules fournissant des informations limitées sur la toxicité induite par le composé d’essai. L’avantage du criblage de toxicité des composés chimiques utilisant des embryons de poisson zèbre est la détection rapide des changements phénotypiques induits chimiquement dans un animal entier pendant le développement embryonnaire dans un organisme modèle pertinent. Environ 70 % des gèn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Sigrid Juselius (SP, MP), de la Fondation culturelle finlandaise (AA, MH), de l’Académie de Finlande (SP, MP), de la Fondation Orion Farmos (MH), de la Tampere Tuberculosis Foundation (SP, MH et MP) et de la Fondation Jane et Aatos Erkko (SP et MP). ). Nous remercions nos collaborateurs italiens et Français, le professeur Supuran et le professeur Winum, d’avoir fourni des inhibiteurs de l’anhydrase carbonique pour l’évaluation de l’innocuité et de la toxicité à des fins de développement de médicaments antituberculeux et anticancéreux. Nous remercions Aulikki Lehmus et Marianne Kuuslahti pour l’assistance technique. Nous remercions également Leena M’kinen et Hannaleena Piippo pour leur aide dans l’élevage et la collecte d’embryons de poissons zèbres. Nous remercions sincèrement Harlan Barker pour l’évaluation critique du manuscrit et les commentaires perspicaces.
Materials
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
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