Zebrabalığı Embriyoları Kullanılarak Kimyasal Bileşiklerin Toksisitesinin Hızlı Değerlendirilmesi
Summary
Zebra balığı embriyoları kimyasal bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılır. Onlar harici geliştirmek ve kimyasallara duyarlı, ince phenotik değişikliklerin tespitine izin. Deney sadece doğrudan embriyo içeren plaka eklenir bileşik küçük bir miktar gerektirir, test sistemi verimli ve maliyet-etkin hale.
Abstract
Zebra balığı hastalık ve fenotip bazlı ilaç keşfi için yaygın olarak kullanılan omurgalı modeli organizmadır. Zebra balığı birçok yavru üretir, şeffaf embriyolar ve hızlı dış gelişim vardır. Zebra balığı embriyoları, bu nedenle, aynı zamanda değerli ve küçük miktarlarda mevcut ilaçların toksisite hızlı değerlendirilmesi için kullanılabilir. Bu makalede, 1-5 günlük gübreleme sonrası embriyolar kullanılarak kimyasal bileşiklerin toksisitesinin etkin bir şekilde taranması için bir yöntem tanımlanmıştır. Embriyolar, farklı bileşik konsantrasyonlarına maruz kalmanın neden olduğu henotipik kusurları araştırmak için stereomikroskop la izlenir. Bileşiklerin yarı maksimal öldürücü konsantrasyonları (LC50)de belirlenir. Bu çalışma bir inhibitör bileşik 3-6 mg gerekli, ve tüm deney temel tesisleri olan bir laboratuvarda bir birey tarafından tamamlanması için yaklaşık 8-10 saat sürer. Mevcut protokol, ilacın keşfinin erken evresinde bileşiğin dayanılmaz toksik veya hedef dışı etkilerini belirlemek ve hücre kültürü veya diğer hayvan modellerinde gözden kaçmış olabilecek ince toksik etkileri tespit etmek için herhangi bir bileşiği test etmek için uygundur. Yöntem, prosedürdeki gecikmeleri ve ilaç geliştirme maliyetlerini azaltır.
Introduction
İlaç geliştirme pahalı bir süreçtir. Tek bir kimyasal bileşik Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) ve Avrupa İlaç Ajansı (EMA) tarafından onaylanmadan önce birkaç bin bileşikler bir milyar doların üzerinde bir maliyetle taranmaktadır1. Preklinik gelişim sırasında, bu maliyetin en büyük kısmı hayvantesti2 için gereklidir. Maliyetleri sınırlamak için, ilaç geliştirme alanında araştırmacılar kimyasal bileşiklerin güvenlik tarama için alternatif modeller gerekir3. Bu nedenle, ilaç gelişiminin erken aşamasında, hızlı bir şekilde uygun bir modelde bileşiklerin güvenlik ve toksisitesini değerlendirebilir bir yöntem kullanmak çok yararlı olacaktır. Hayvan ve hücre kültürü modellerini içeren kimyasal bileşiklerin toksisite taraması için kullanılan çeşitli protokoller vardır ama doğrulanır ve ortak kullanımda olan tek bir protokol yoktur4,5. Zebra balığı kullanarak mevcut protokoller uzunluğu değişir ve kendi kolaylık gereksinimi6,7,8,9 , olarak toksisite değerlendirildi bireysel araştırmacılar tarafından kullanılmıştır 10.000 , 11.11.20 , 12. Yıl.
Yakın geçmişte, zebra balığı embriyonik gelişim sırasında kimyasal bileşiklerin toksisite değerlendirilmesi için uygun bir model olarak ortaya çıkmıştır6,7. Zebra balığı kimyasal bileşiklerin değerlendirilmesi için birçok dahili avantajları vardır13. Hatta büyük ölçekli deneyler münasip, bir zebra balığı dişi hızla ex vivogeliştirmek 200-300 yumurta, toplu koyabilirsiniz gibi, bir haftakadar dış besleme gerekmez ve şeffaf. Bileşikler doğrudan suya eklenebilir, nerede (bileşiğin doğasına bağlı olarak) chorion yoluyla yayılır, ve yumurtadan sonra, deri yoluyla, solungaçları ve larvaağız. Deneyler, embriyonun küçük boyutu nedeniyle14 kimyasal bileşiklerin bol miktarda gerektirmez. Zebra balığı embriyolarının geliştirilmesi, normal gelişimsel sonuca ulaşmak için gereken proteinlerin çoğunu ifade eder. Bu nedenle, bir zebra balığı embriyopotansiyel bir ilaç bir protein veya sinyal molekülünün işlevini bozabilir olup olmadığını değerlendirmek için hassas bir modeldir. Zebra balığının organları 2-5 dpf15arasında işlevsel hale gelir ve embriyonik gelişimin bu hassas döneminde toksik olan bileşikler zebra balığı larvalarında henotik bozukluklara neden olur. Bu fenotipik değişiklikler kolayca invaziv teknikler olmadan basit bir mikroskop kullanılarak tespit edilebilir11. Zebrabalığı embriyoları yaygın hücre kültürü modelleri kullanarak in vitro ilaç tarama göre çok daha büyük biyolojik karmaşıklığı nedeniyle toksikolojik araştırmalarda kullanılır16,17. Bir omurgalı olarak, zebra balığı genetik ve fizyolojik makyaj insanlar ve dolayısıyla kimyasal bileşiklerin toksisite zebra balığı ve insanlar arasında benzer karşılaştırılabilir8,18,19, 20.000 , 21.000 , 22. Zebrabalığı, böylece, kimyasal bileşiklerin toksisite ve güvenlik değerlendirmesi için ilaç keşif erken aşamasında değerli bir araçtır.
Bu makalede, tek bir araştırmacı tarafından 1-5 günlük post fertilizasyon (dpf) zebra balığı embriyoları kullanılarak karbonik anhidraz (CA) inhibitör bileşiklerinin güvenliğini ve toksisitesini değerlendirmek için kullanılan yöntemin ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Protokol, zebra balığı embriyolarının farklı kimyasal inhibitör bileşiklerkonsantrasyonlarına maruz kalmalarını ve embriyonik gelişim sırasındaki mortalite ve henotik değişimleri incelemeyi içerir. Kimyasal bileşiklere maruz kalma sonunda, kimyasal LC50 doz belirlenir. Bu yöntem bireyin 1-5 test bileşiğinin verimli taramasını gerçekleştirmesini sağlar ve yöntemle kişinin deneyiminebağlı olarak yaklaşık 8-10 saat sürer (Şekil 1). Bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için gereken adımların her biri Şekil2’de özetlenmiştir. CA inhibitörlerinin toksisitesinin değerlendirilmesi 8 gün gerektirir ve çiftleşerek çiftleşerek çiftleşerek (1. gün) kurulmasını içerir; embriyoların üreme tanklarından toplanması, temizlenmesi ve 28,5 °C’ye aktarılması (2. gün); 24-iyi plaka kuyularına embriyoların dağılımı ve seyreltilmiş CA inhibitörü bileşiklerin eklenmesi (gün 3); larvaların fenotipik analizi ve görüntülemesi (gün 4-8) ve LC50 dozu (gün8) tayini. Bu yöntem hızlı ve verimli, kimyasal bileşik ve laboratuvar sadece temel tesisleri küçük bir miktar gerektirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kültürlü hücreler kullanılarak yapılan in vitro toksisite testi, test bileşiğinin neden olduğu toksisite hakkında sınırlı bilgi sağlayan hücrelerin hayatta kalma ve morfolojik çalışmalarını tespit edebilir. Zebra balığı embriyoları kullanılarak kimyasal bileşiklerin toksisite tarama avantajı ilgili bir model organizmada embriyonik gelişim sırasında bütün bir hayvankimyasal kaynaklı phenotik değişikliklerin hızlı tespitidir. Protein kodlayan insan genlerinin yaklaşık %70’ind…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma Sigrid Juselius Vakfı (SP, MP), Finlandiya Kültür Vakfı (AA, MH), Finlandiya Akademisi (SP, MP), Orion Farmos Vakfı (MH), Tampere Tüberküloz Vakfı (SP, MH ve MP) ve Jane ve Aatos Erkko Vakfı (SP ve MP) hibe ile desteklendi ). İtalyan ve Fransız işbirlikçilerimiz Prof. Supuran ve Prof. Winum’a anti-TB ve anti-kanser ilaç geliştirme amaçları için güvenlik ve toksisite değerlendirmesi için karbonik anhidraz inhibitörleri sağladıklarından dolayı teşekkür ederiz. Aulikki Lehmus ve Marianne Kuuslahti’ye teknik yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Leena Mäkinen ve Hannaleena Piippo’ya zebra balığı üremesi ve embriyo toplama konusunda yardımcı olmaları için teşekkür ederiz. Harlan Barker’a el yazmasının eleştirel değerlendirmesi ve anlayışlı yorumları için içtenlikle teşekkür ederiz.
Materials
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. Alternative models in developmental toxicology. Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research–advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
