ゼブラフィッシュ胚を用いる化学化合物の毒性の迅速評価
Summary
ゼブラフィッシュ胚は、化学化合物の毒性を評価するために使用されます。それらは外部で発達し、化学物質に敏感であり、微妙な形知らずの変化の検出を可能にする。実験は少量の化合物しか必要としないが、これは胚を含むプレートに直接添加され、試験システムを効率的かつ費用対効果の高い方法にする。
Abstract
ゼブラフィッシュは、疾患および表現型ベースの創薬のために広く使用されている脊椎動物モデル生物である。ゼブラフィッシュは、多くの子孫を生成し、透明な胚と迅速な外部発達を有する。したがって、ゼブラフィッシュ胚は、貴重で少量で入手可能な薬物の毒性の迅速な評価にも使用することができる。本記事では、1〜5日後受精胚を用いて化学化合物の毒性を効率的にスクリーニングする方法について説明する。胚は、化合物の異なる濃度への暴露によって引き起こされる見型学的欠陥を調査するために、立体顕微鏡によって監視されます。化合物の半分最大致死濃度(LC50)も決定される。本研究では、阻害剤化合物の3〜6mgを必要とし、実験全体は、基本的な設備を有する実験室の個人が完了するのに約8〜10時間かかります。現在のプロトコルは、創薬の初期段階で化合物の耐えうない毒性またはオフターゲット効果を識別し、細胞培養または他の動物モデルで見逃される可能性のある微妙な毒性効果を検出するために、任意の化合物をテストするのに適しています。この方法は、手続き上の遅延と薬剤開発のコストを削減します。
Introduction
医薬品開発は高価なプロセスです。単一の化学化合物が食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁(EMA)によって承認される前に、数千の化合物が10億ドル以上の費用でスクリーニングされます1.前臨床開発の間、この費用の最も大きい部分は動物実験2のために要求される。コストを制限するために、医薬品開発の分野の研究者は、化学化合物3の安全性スクリーニングのための代替モデルを必要とします。したがって、薬剤開発の初期段階では、適切なモデルにおける化合物の安全性および毒性を迅速に評価できる方法を用いることは非常に有益であろう。動物および細胞培養モデルを含む化学化合物の毒性スクリーニングに使用されているいくつかのプロトコルがありますが、検証され、一般的に使用される単一のプロトコルはありません 4,5.ゼブラフィッシュを使用する既存のプロトコルは、長さが異なり、利便性要件6、7、8、9、および、その利便性要件に従って毒性を評価した個々の研究者によって使用されています。10歳,11歳,12.
最近では、ゼブラフィッシュは、胚発生時の化学化合物の毒性の評価のための便利なモデルとして浮上している 6,7.ゼブラフィッシュは、化学化合物13の評価のための多くの内蔵の利点を有する。ゼブラフィッシュメスは、急速にex vivoを開発し、200〜300個の卵のバッチを産むことができるので、大規模な実験でさえ、1週間まで外部摂食を必要とせず、透明である。化合物は、彼らが(化合物の性質に応じて)絨皮を通して拡散することができ、そして孵化後、皮膚、エラおよび幼虫の口を通して、水に直接添加することができる。実験は、胚の小さなサイズのために大量の化学化合物14を必要としない。ゼブラフィッシュ胚の開発は、正常な発達結果を達成するために必要なタンパク質のほとんどを発現する。したがって、ゼブラフィッシュ胚は、潜在的な薬物が発達的に重要なタンパク質またはシグナル伝達分子の機能を妨げることができるかどうかを評価する敏感なモデルである。ゼブラフィッシュの器官は2-5 dpf15の間で機能し、胚発生のこの敏感な期間中に有毒である化合物は、ゼブラフィッシュ幼虫のフェノティピック欠陥を誘発する。これらの型分法の変化は、侵襲的な技術を用いずに単純な顕微鏡を用いて容易に検出することができる11.ゼブラフィッシュ胚は、細胞培養モデル16,17を用いてインビトロ薬物スクリーニングに比べて生物学的複雑性が非常に大きいため、毒物学的研究に広く使用されている。 脊椎動物として、ゼブラフィッシュの遺伝的および生理学的構成はヒトに匹敵し、したがって化学化合物の毒性はゼブラフィッシュとヒト8、18、19の間で類似している。20歳,21歳,22.ゼブラフィッシュは、したがって、化学化合物の毒性および安全性の評価のための創薬の初期段階における貴重なツールである。
本稿では、1~5日間の受精後受精(dpf)ゼブラフィッシュ胚を用いて炭酸アンヒドラーゼ(CA)阻害剤化合物の安全性と毒性を評価するために用いられる方法の詳細な説明を、単一の研究者による。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚を異なる濃度の化学阻害剤化合物に暴露し、胚発生時の死亡率および先記異動の変化を研究することを含む。化学化合物への曝露の終わりに、化学物質のLC50用量が決定される。この方法は、個人が1〜5の試験化合物の効率的なスクリーニングを行うことを可能にし、方法を持つ人の経験に応じて約8〜10時間かかります(図1)。化合物の毒性を評価するために必要な各ステップは、図2に概説されています。CA阻害剤の毒性の評価は8日を必要とし、交配ペアの設定を含む(1日目)。繁殖タンクから胚のコレクション, 洗浄し、28.5 °Cインキュベーターに転送 (2 日目);24ウェルプレートのウェルへの胚の分布と希釈されたCA阻害剤化合物の添加(3日目)。幼虫のフェ記視分析および画像化(4~8日目)、およびLC50用量(day8)の決定。 この方法は、迅速かつ効率的であり、少量の化学化合物と実験室の基本的な設備のみを必要とする。
Protocol
Representative Results
Discussion
培養細胞を用いてインビトロ毒性試験は、試験化合物によって誘導される毒性に関する限られた情報を提供する細胞の生存および形態学的研究を検出することができる。ゼブラフィッシュ胚を用いた化学化合物の毒性スクリーニングの利点は、関連するモデル生物における胚発生時の動物全体における化学的に誘発された型分法変化の迅速な検出である。タンパク質コードヒト遺伝子?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この活動は、シグリッド・ジュセリウス財団(SP、MP)、フィンランド文化財団(AA、MH)、フィンランドアカデミー(SP、MP)、オリオン・ファルモス財団(MH)、タンペレ結核財団(SP、MH、MP)、ジェーン・アンド・アトス・エルコ財団(SP、MP)からの助成金によって支援されました。).イタリアとフランスの共同研究者であるスプーラン教授とウィナム教授は、抗結核および抗がん剤開発目的で安全性と毒性評価のための炭酸アンヒドラーゼ阻害剤を提供してくれたことに感謝します。アウリッキ・レムムスとマリアンヌ・クスラフティの技術支援に感謝します。我々はまた、ゼブラフィッシュの繁殖と胚の収集に彼らの助けのためにリーナ・メキネンとハンナリーナ・ピッポに感謝します。私たちは、原稿と洞察力に満ちたコメントの批判的な評価のためにハーラン・バーカーに心から感謝します。
Materials
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. Alternative models in developmental toxicology. Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research–advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
