Zebrafisch-Embryonen werden zur Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen verwendet. Sie entwickeln sich extern und reagieren empfindlich auf Chemikalien, was den Nachweis subtiler phäotypischer Veränderungen ermöglicht. Das Experiment benötigt nur eine geringe Menge an Verbindung, die direkt auf die Platte mit Embryonen zugesetzt wird, was das Testsystem effizient und kostengünstig macht.
Der Zebrafisch ist ein weit verbreiteter Wirbeltiermodellorganismus für die Krankheit und phänotypbasierte Arzneimittelentdeckung. Der Zebrafisch erzeugt viele Nachkommen, hat transparente Embryonen und eine schnelle äußere Entwicklung. Zebrafisch-Embryonen können daher auch für die schnelle Bewertung der Toxizität der Medikamente verwendet werden, die wertvoll sind und in kleinen Mengen erhältlich sind. In diesem Artikel wird ein Verfahren zum effizienten Screening der Toxizität chemischer Verbindungen mit 1-5-Tage-Embryonen nach der Befruchtung beschrieben. Die Embryonen werden durch Stereomikroskop überwacht, um die phänotypischen Defekte zu untersuchen, die durch die Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Verbindungen verursacht werden. Halbmaximale tödliche Konzentrationen (LC50) der Verbindungen werden ebenfalls bestimmt. Die vorliegende Studie erforderte 3-6 mg einer Inhibitorverbindung, und das ganze Experiment dauert etwa 8-10 h, um von einer Person in einem Labor mit grundlegenden Einrichtungen abgeschlossen werden. Das aktuelle Protokoll eignet sich zum Testen jeder Verbindung, um unerträgliche toxische oder zielferne Wirkungen der Verbindung in der frühen Phase der Arzneimittelentdeckung zu identifizieren und subtile toxische Wirkungen zu erkennen, die in der Zellkultur oder anderen Tiermodellen übersehen werden können. Die Methode reduziert Verfahrensverzögerungen und Kosten der Arzneimittelentwicklung.
Die Arzneimittelentwicklung ist ein teurer Prozess. Bevor eine einzige chemische Verbindung von der Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel-Agentur (EMA) zugelassen wird, werden mehrere tausend Verbindungen zu einem Preis von über einer MilliardeDollar1 gescreent. Während der präklinischen Entwicklung wird der größte Teil dieser Kosten für dieTierversuche2 benötigt. Um die Kosten zu begrenzen, benötigen Forscher auf dem Gebiet der Arzneimittelentwicklung alternative Modelle für das Sicherheitsscreening chemischer Verbindungen3. Daher wäre es in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung sehr vorteilhaft, eine Methode zu verwenden, die die Sicherheit und Toxizität der Verbindungen in einem geeigneten Modell schnell bewerten kann. Es gibt mehrere Protokolle, die für das Toxizitätsscreening von chemischen Verbindungen mit Tier- und Zellkulturmodellen verwendet wurden, aber es gibt kein einziges Protokoll, das validiert ist und häufig verwendet wird4,5. Vorhandene Protokolle mit Zebrafischen variieren in der Länge und wurden von einzelnen Forschern verwendet, die die Toxizität nach ihrer Bequemlichkeit Anforderung 6,7,8,9 , 10 , 11 , 12.
In der jüngsten Vergangenheit hat sich der Zebrafisch als ein bequemes Modell für die Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen während der embryonalen Entwicklung6,7herauskristallisiert. Der Zebrafisch hat viele eingebaute Vorteile für die Bewertung chemischer Verbindungen13. Selbst groß angelegte Experimente sind möglich, da ein Zebrafischweibchen Chargen von 200-300 Eiern legen kann, die sich ex vivoschnell entwickeln, bis zu einer Woche keine externe Fütterung benötigen und transparent sind. Die Verbindungen können direkt in das Wasser hinzugefügt werden, wo sie (je nach Art der Verbindung) durch die Chorion und nach dem Schlüpfen, durch die Haut, Kiemen und Mund von Larven diffundieren können. Die Experimente erfordern aufgrund der geringen Größe des Embryos keine großen Mengen chemischer Verbindungen14. Die Entwicklung von Zebrafischembryonen drückt die meisten Proteine aus, die erforderlich sind, um das normale Entwicklungsergebnis zu erzielen. Daher ist ein Zebrafisch-Embryo ein empfindliches Modell, um zu beurteilen, ob ein potenzielles Medikament die Funktion eines Proteins oder Signalmoleküls stören kann, das entwicklungssignifikant ist. Die Organe der Zebrafische werden zwischen 2-5 dpf15funktionsfähig, und Verbindungen, die während dieser sensiblen Phase der embryonalen Entwicklung giftig sind, induzieren phänotychen defekte Zebrafischlarven. Diese phäotypischen Veränderungen lassen sich mit einem einfachen Mikroskop ohne invasive Techniken leicht erkennen11. Zebrafisch-Embryonen werden in der toxikologischen Forschung aufgrund ihrer viel größeren biologischen Komplexität im Vergleich zum In-vitro-Arzneimittel-Screening mit Zellkulturmodellen16,17weit verbreitet. Als Wirbeltier ist die genetische und physiologische Zusammensetzung von Zebrafischen mit dem Menschen vergleichbar und daher sind die Toxizitäten chemischer Verbindungen zwischen Zebrafischen und Menschen ähnlich8,18,19, 20 , 21 , 22. Zebrafisch ist somit ein wertvolles Instrument in der frühen Phase der Arzneimittelentdeckung zur Bewertung der Toxizität und Sicherheit der chemischen Verbindungen.
In diesem Artikel enthalten wir eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens zur Bewertung der Sicherheit und Toxizität von Kohlensäureanhydrase (CA)-Inhibitorverbindungen unter Verwendung von 1-5-Tage-Zebrafischembryonen (dpf) von einem einzigen Forscher. Das Protokoll beinhaltet die Exposition von Zebrafischembryonen gegenüber verschiedenen Konzentrationen chemischer Inhibitorverbindungen und die Untersuchung der Mortalität und der phänotypischen Veränderungen während der embryonalen Entwicklung. Am Ende der Exposition gegenüber den chemischen Verbindungen wird die LC 50-Dosis der Chemikalie bestimmt. Das Verfahren ermöglicht es einem Individuum, effizientes Screening von 1-5 Testverbindungen durchzuführen und dauert etwa 8-10 h, abhängig von der Erfahrung der Person mit der Methode (Abbildung 1). Jeder der Schritte, die zur Beurteilung der Toxizität der Verbindungen erforderlich sind, ist in Abbildung 2dargestellt. Die Bewertung der Toxizität von CA-Inhibitoren erfordert 8 Tage und umfasst die Einrichtung von Paarungspaaren (Tag 1); Entnahme von Embryonen aus Zuchttanks, Reinigung und Übertragung in 28,5 °C Brutkasten (Tag 2); Verteilung der Embryonen in die Brunnen einer 24-Well-Platte und Zugabe von verdünnten CA-Hemmerverbindungen (Tag 3); phätagische Analyse und Bildgebung von Larven (Tag 4-8) und Bestimmung der LC50-Dosis (Tag8). Diese Methode ist schnell und effizient, erfordert eine kleine Menge der chemischen Verbindung und nur grundlegende Einrichtungen des Labors.
In-vitro-Toxizitätstests mit kultivierten Zellen können Überlebens- und morphologische Studien der Zellen erkennen, die begrenzte Informationen über die durch die Testverbindung induzierte Toxizität liefern. Der Vorteil des Toxizitätsscreenings chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen ist der schnelle Nachweis chemisch induzierter phänotischer Veränderungen bei einem ganzen Tier während der embryonalen Entwicklung in einem relevanten Modellorganismus. Ungefähr 70% der proteinkodierenden menschli…
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeit wurde durch Stipendien der Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), der Finnischen Kulturstiftung (AA, MH), der Akademie Finnlands (SP, MP), der Orion Farmos Foundation (MH), der Tampere Tuberculosis Foundation (SP, MH und MP) und Der Jane and Aatos Erkko Foundation (SP und MP) unterstützt. ). Wir danken unseren italienischen und französischen Mitarbeitern, Prof. Supuran und Prof. Winum, für die Bereitstellung von Kohlensäure-Anhydrase-Inhibitoren für die Sicherheits- und Toxizitätsbewertung für Anti-TB- und Anti-Krebs-Medikamente-Entwicklungszwecke. Wir danken Aulikki Lehmus und Marianne Kuuslahti für die technische Unterstützung. Wir danken auch Leena Mäkinen und Hannaleena Piippo für ihre Hilfe bei der Zebrafischzucht und -sammlung von Embryonen. Wir danken Harlan Barker aufrichtig für die kritische Bewertung des Manuskripts und aufschlussreiche Kommentare.
24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |