Zebrafish 배아를 이용한 화학 화합물의 독성에 대한 신속한 평가
Summary
Zebrafish 배아는 화학 화합물의 독성을 평가하는 데 사용됩니다. 그들은 외부에서 개발하고 미묘한 자형기능 변화의 검출을 허용, 화학 물질에 민감하다. 실험은 배아를 함유하는 플레이트에 직접 첨가되는 소량의 화합물만을 필요로 하므로 테스트 시스템이 효율적이고 비용 효율적입니다.
Abstract
제브라피쉬는 질병 및 표현형 기반 약물 발견을 위해 널리 사용되는 척추동물 모델 유기체이다. 얼룩말 물고기는 많은 자손을 생성, 투명 한 배아와 빠른 외부 개발. 따라서 Zebrafish 배아는 소중하고 소량으로 사용할 수 있는 약물의 독성을 신속하게 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다. 본 기사에서는, 1-5일 후 수정 배아를 이용한 화학 화합물의 독성을 효율적으로 스크리닝하는 방법에 대해 설명한다. 배아는 화합물의 다른 농도에 노출에 기인한 현상형 결함을 조사하기 위하여 입체 현미경에 의해 감시됩니다. 화합물의 반 최대 치명적인농도 (LC 50)도 결정 됩니다. 본 연구는 억제제 화합물의 3-6 mg을 요구했으며, 전체 실험은 기본 시설을 갖는 실험실에서 개인에 의해 완료되기까지 약 8-10 시간이 소요됩니다. 현재 프로토콜은 약물 발견의 초기 단계에서 화합물의 참을 수 없는 독성 또는 오프 타겟 효과를 식별하고 세포 배양 또는 다른 동물 모델에서 놓칠 수 있는 미묘한 독성 효과를 검출하기 위해 임의의 화합물을 테스트하는 데 적합하다. 이 방법은 절차 지연 및 약물 개발 비용을 줄입니다.
Introduction
약물 개발은 비용이 많이 드는 과정입니다. 단일 화학 화합물이 식품 의약국 (FDA)과 유럽 의약품 기구 (EMA)에 의해 승인되기 전에 수천 개의화합물이 10 억 달러 이상의 비용으로 선별됩니다 1. 전임상 개발 동안, 이 비용의 가장 큰 부분은동물 실험에 필요한 2. 비용을 제한하기 위해, 약물 개발 분야의 연구자들은 화학 화합물의 안전성 스크리닝을위한 대체 모델이 필요합니다 3. 따라서, 약물 개발의 초기 단계에서, 적합한 모델에서 화합물의 안전성 및 독성을 신속하게 평가할 수 있는 방법을 사용하는 것이 매우 유익할 것이다. 동물 및 세포 배양 모델을 포함하는 화학 화합물의 독성 스크리닝에 사용되는 여러 프로토콜이 있지만 검증되고 공통사용되는단일 프로토콜은 없다 4,5. zebrafish를 이용한 기존 프로토콜은 길이가 다양하며 편의요건6, 7,8,9에 따라 독성을 평가한 개별 연구자들이 사용하고 있습니다. 10개 , 11세 , 12.
최근, 제브라피쉬는 배아 개발 시 화학물질의 독성을 평가하는 편리한 모델로 대두되어있다6,7. 제브라피쉬는 화학화합물(13)의 평가에많은 내장장점을 갖는다. 심지어 대규모 실험은 제브라피쉬 여성이 200-300 개의 계란을 배치 할 수 있기 때문에 급속하게 생체 내생체 내에서 발달할 수 있으며 최대 1 주일 동안 외부 먹이가 필요하지 않으며 투명합니다. 화합물은 물 속으로 직접 첨가 될 수 있으며, 여기서 (화합물의 특성에 따라) 융모를 통해 확산되고 부화 후 피부, 아가미 및 유충의 입을 통해 확산 될 수 있습니다. 실험은 배아의 작은 크기 로 인해 풍부한 양의 화학 화합물(14)을 필요로하지 않는다. 제브라피시 배아를 개발하는 것은 정상적인 발달 결과를 달성하는 데 필요한 대부분의 단백질을 표현합니다. 따라서, 제브라피쉬 배아는 잠재적인 약물이 발달적으로 유의한 단백질 또는 신호 분자의 기능을 방해할 수 있는지 여부를 평가하는 민감한 모델이다. 제브라피쉬의 장기는 2-5 dpf15사이의 기능적이 되고, 배아 발달의 이 민감한 기간 동안 독성이 있는 화합물은 제브라피시 유충의 현상형 결함을 유발한다. 이러한 현상형 변화는 침습적 기술11없이 간단한 현미경을 사용하여 쉽게 검출될 수 있다. Zebrafish 배아는 세포 배양 모델16,17을사용하여 시험관내 약물 스크리닝에 비해 훨씬 더 큰 생물학적 복잡성으로 인해 독성 연구에서 널리 사용된다. 척추동물로서, 제브라피쉬의 유전적, 생리학적 구성은 인간과 비교할 수 있으며, 따라서 화학물질의 독성은 제브라피시와 인간8,18,19, 20개 , 21세 , 22. Zebrafish는, 따라서, 화학 화합물의 독성 및 안전성의 평가를 위한 약물 발견의 초기 단계에서 귀중한 도구이다.
본 기사에서는, 단일 연구자가 1-5일 후 수정(dpf) 제브라피시 배아를 사용하여 탄산 무수효소(CA) 억제제 화합물의 안전성 및 독성을 평가하는 데 사용되는 방법에 대한 상세한 설명을 제공합니다. 프로토콜은 화학 억제제 화합물의 다른 농도에 제브라피시 배아를 노출하고 배아 발달 도중 사망과 현상형 변경을 공부하는 관련시킵니다. 화학 화합물에 대한 노출이 끝나면, 화학 물질의 LC50 투여량이 결정된다. 이 방법은 개인이 1-5 개의 시험 화합물을 효율적으로 선별 할 수 있게하고 방법을 가진 사람의 경험에따라 약 8-10 시간이 걸립니다 (그림 1). 화합물의 독성을 평가하는 데 필요한 각 단계는 도2에 설명되어 있다. CA 억제제의 독성 평가는 8 일이 필요하며, 짝짓기 쌍의 설정 (1 일째)을 포함한다; 사육 탱크에서 배아의 수집, 청소 및 28.5 °C 인큐베이터로 전송 (2 일); 24 웰 플레이트의 우물에 배아의 분포와 희석 CA 억제제 화합물의 추가 (3 일째); 유충의 phenotypic 분석 및 이미징 (일 4-8), LC의 결정50 투여량 (day8). 이 방법은 신속하고 효율적이며 소량의 화학 화합물과 실험실의 기본 시설만 필요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
배양된 세포를 이용한 시험관내 독성 시험은 시험 화합물에 의해 유도된 독성에 대한 제한된 정보를 제공하는 세포의 생존 및 형태학적 연구를 검출할 수 있다. 제브라피시 배아를 이용한 화학 화합물의 독성 스크리닝의 장점은 관련 모델 유기체에서 배아 개발 동안 전체 동물에서 화학적으로 유도된 현상형 변화를 신속하게 검출하는 것이다. 단백질 코딩 인간 유전자의 약 70%는 제브라피?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 시그리드 주셀리우스 재단(SP, MP), 핀란드 문화 재단(AA, MH), 핀란드 아카데미(SP, MP), 오리온 파노스 재단(MH), 탐페레 결핵 재단(SP, MH 및 MP), 제인 과 아토스 에르코 재단(SP 및 MP)의 보조금으로 지원되었습니다. ). 우리는 항결핵 및 항암 제 개발 목적을 위한 안전성 및 독성 평가를 위한 탄산 아수드라아제 억제제를 제공한 이탈리아와 프랑스 협력자, 수푸란 교수 및 Winum 교수에게 감사드립니다. 아울릭키 레무스와 마리안 쿠슬라티에게 기술 지원에 감사드립니다. 우리는 또한 제브라피시 사육과 배아 수집에 도움을 준 리나 메키넨과 한날리나 피포에게 감사를 표합니다. 우리는 진심으로 원고와 통찰력있는 의견의 비판적 평가 할란 바커에게 감사드립니다.
Materials
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
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