Rapida valutazione della tossicità dei composti chimici utilizzando gli embrioni di pesce zebra
Summary
Gli embrioni di pesce zebra vengono utilizzati per valutare la tossicità dei composti chimici. Si sviluppano esternamente e sono sensibili alle sostanze chimiche, consentendo il rilevamento di sottili cambiamenti fenotipici. L’esperimento richiede solo una piccola quantità di composto, che viene aggiunto direttamente alla piastra contenente embrioni, rendendo il sistema di test efficiente e conveniente.
Abstract
Il pesce zebra è un organismo modello di vertebrato ampiamente utilizzato per la malattia e la scoperta di farmaci basati sul fenotipo. Il pesce zebra genera molti figli, ha embrioni trasparenti e rapido sviluppo esterno. Gli embrioni di pesce zebra possono quindi essere utilizzati anche per la rapida valutazione della tossicità dei farmaci preziosi e disponibili in piccole quantità. Nel presente articolo, viene descritto un metodo per lo screening efficiente della tossicità dei composti chimici utilizzando embrioni post-fecondazione di 1-5 giorni. Gli embrioni sono monitorati da stereomicroscopiper per studiare i difetti fenotipici causati dall’esposizione a diverse concentrazioni di composti. Vengono inoltre determinate concentrazioni letali semimassi (LC50) dei composti. Il presente studio ha richiesto 3-6 mg di un composto inibitore, e l’intero esperimento richiede circa 8-10 h per essere completato da un individuo in un laboratorio con strutture di base. Il protocollo attuale è adatto per testare qualsiasi composto per identificare effetti tossici o fuori bersaglio intollerabili del composto nella fase iniziale della scoperta di farmaci e per rilevare sottili effetti tossici che possono essere persi nella coltura cellulare o in altri modelli animali. Il metodo riduce i ritardi procedurali e i costi dello sviluppo di farmaci.
Introduction
Lo sviluppo di farmaci è un processo costoso. Prima che un singolo composto chimico è approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) e L’Agenzia europea dei medicinali (EMA) diverse migliaia di composti sono sottoposti a un costo di oltre un miliardo di dollari1. Durante lo sviluppo preclinico, la maggior parte di questo costo è necessaria per la sperimentazione animale2. Per limitare i costi, i ricercatori nel campo dello sviluppo di farmaci hanno bisogno di modelli alternativi per lo screening di sicurezza dei composti chimici3. Pertanto, nella fase iniziale dello sviluppo del farmaco, sarebbe molto utile utilizzare un metodo in grado di valutare rapidamente la sicurezza e la tossicità dei composti in un modello adatto. Ci sono diversi protocolli che sono stati utilizzati per lo screening della tossicità di composti chimici che coinvolgono modelli di coltura animale e cellulare, ma non c’è un unico protocollo che viene convalidato ed è in uso comune4,5. I protocolli esistenti che utilizzano il pesce zebra variano in lunghezza e sono stati utilizzati da singoli ricercatori che hanno valutato la tossicità in base al loro requisito di convenienza6,7,8,9, 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12.
Nel recente passato, il pesce zebra è emerso come un modello conveniente per la valutazione della tossicità dei composti chimici durante lo sviluppo embrionale6,7. Il pesce zebra ha molti vantaggi integrati per la valutazione dei composti chimici13. Anche gli esperimenti su larga scala sono suscettibili, in quanto una femmina di pesce zebra può deporre lotti di 200-300 uova, che si sviluppano rapidamente ex vivo, non hanno bisogno di alimentazione esterna fino a una settimana e sono trasparenti. I composti possono essere aggiunti direttamente nell’acqua, dove possono (a seconda della natura del composto) diffuso attraverso il chorion, e dopo la schiusa, attraverso la pelle, branchie e bocca delle larve. Gli esperimenti non richiedono abbondanti quantità di composti chimici14 a causa delle piccole dimensioni dell’embrione. Lo sviluppo di embrioni di pesce zebra esprimono la maggior parte delle proteine necessarie per ottenere il normale risultato dello sviluppo. Pertanto, un embrione di pesce zebra è un modello sensibile per valutare se un potenziale farmaco può disturbare la funzione di una proteina o di una molecola di segnalazione che è significativa dal punto di vista dello sviluppo. Gli organi del pesce zebra diventano funzionali tra 2-5 dpf15, e composti tossici durante questo periodo delicato di sviluppo embrionale inducono difetti fenotipici nelle larve di pesce zebra. Questi cambiamenti fenotipici possono essere facilmente rilevati utilizzando un semplice microscopio senza tecniche invasive11. Gli embrioni di pesce zebra sono ampiamente utilizzati nella ricerca tossicologica a causa della loro complessità biologica molto maggiore rispetto allo screening farmacologico in vitro utilizzando modelli di coltura cellulare16,17. Come vertebrato, la composizione genetica e fisiologica del pesce zebra è paragonabile agli esseri umani e quindi le tossicità dei composti chimici sono simili tra il pesce zebra e gli esseri umani8,18,19, 20 anni , 21 Mieto , 22. Il pesce zebra è quindi uno strumento prezioso nella fase iniziale della scoperta di farmaci per la valutazione della tossicità e della sicurezza dei composti chimici.
Nel presente articolo, forniamo una descrizione dettagliata del metodo utilizzato per valutare la sicurezza e la tossicità dei composti inibitori dell’andrasi (CA) carbonico utilizzando embrioni di pesce zebra post-5 giorni (dpf) da un singolo ricercatore. Il protocollo prevede l’esposizione degli embrioni di pesce zebra a diverse concentrazioni di composti inibitori chimici e lo studio della mortalità e dei cambiamenti fenotipici durante lo sviluppo embrionale. Alla fine dell’esposizione ai composti chimici, viene determinata la dose LC50 della sostanza chimica. Il metodo consente a un individuo di effettuare uno screening efficiente di 1-5 composti di prova e richiede circa 8-10 h a seconda dell’esperienza della persona con il metodo (Figura 1). Ciascuno dei passaggi necessari per valutare la tossicità dei composti è descritto nella Figura 2. La valutazione della tossicità degli inibitori della CA richiede 8 giorni e include l’impostazione di coppie di accoppiamento (giorno 1); raccolta di embrioni da serbatoi di riproduzione, pulizia e trasferimento a 28,5 gradi centigradi (giorno 2); distribuzione degli embrioni nei pozzi di una piastra di 24 pozze e aggiunta di composti inibitori CA diluiti (giorno 3); l’analisi fenotipica e l’imaging delle larve (giorno 4-8) e la determinazione della dose di LC50 (giorno8). Questo metodo è rapido ed efficiente, richiede una piccola quantità del composto chimico e solo strutture di base del laboratorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il test di tossicità in vitro con cellule coltivate è in grado di rilevare la sopravvivenza e gli studi morfologici delle cellule fornendo informazioni limitate sulla tossicità indotta dal composto di prova. Il vantaggio dello screening della tossicità dei composti chimici che utilizzano embrioni di pesce zebra è la rapida individuazione di cambiamenti fenotipici indotti chimicamente in un intero animale durante lo sviluppo embrionale in un organismo modello pertinente. Circa il 70% dei geni umani che codif…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), della Finnish Cultural Foundation (AA, MH), dell’Accademia della Finlandia (SP, MP), della Orion Farmos Foundation (MH), della Fondazione Tampere Tuberculosis (SP, MH e MP) e della Fondazione Jane e Aatos Erkko (SP e MP) ). Ringraziamo i nostri collaboratori italiani e francesi, il professor Supuran, e il professor Winum, per aver fornito inibitori all’andradica carbonica per la valutazione della sicurezza e della tossicità per scopi di sviluppo di farmaci anti-TB e anti-cancro. Ringraziamo Aulikki Lehmus e Marianne Kuuslahti per l’assistenza tecnica. Ringraziamo anche Leena Makinen e Hannaleena Piippo per il loro aiuto con l’allevamento dei pesci zebra e la raccolta degli embrioni. Ringraziamo sinceramente Harlan Barker per la valutazione critica del manoscritto e commenti approfonditi.
Materials
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
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