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Immunology and Infection

फल मक्खी, Drosophila melanogasterके सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन, Vivo Phagocytosis परख में एक का उपयोग

Published: April 10, 2019 doi: 10.3791/59543
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biology, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, 3Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Summary

यह प्रोटोकॉल वयस्क Drosophila मेलानोगैस्टर में vivo phagocytosis परख में एक का वर्णन phagocyte मांयता और माइक्रोबियल संक्रमण की मंजूरी मात्रा ।

Abstract

सभी जानवरों में, सहज प्रतिरक्षा रोगजनकों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के खिलाफ एक तत्काल और मजबूत रक्षा प्रदान करता है । Humoral और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं सहज प्रतिरक्षा की मुख्य शाखाओं रहे हैं, और इन प्रतिक्रियाओं को विनियमित कारकों के कई विकासवादी और स्तनधारियों के बीच का संरक्षण कर रहे हैं । फेगोसाइटोसिस, सेलुलर सहज प्रतिरक्षा के केंद्रीय घटक, प्रतिरक्षा प्रणाली के विशेष रक्त कोशिकाओं द्वारा किया जाता है । फल मक्खी, Drosophila मेलानोगैस्टर, एक शक्तिशाली आनुवंशिक मॉडल के रूप में उभरा है आणविक तंत्र और पूरे जानवरों में भगोसाइटोसिस के शारीरिक प्रभावों की जांच । यहां हम एक इंजेक्शन का प्रदर्शन-vivo phagocytosis परख में आधारित कण और Drosophila रक्त कोशिकाओं, hemocytes द्वारा विनाश को बढ़ाता है । प्रक्रिया शोधकर्ताओं ठीक कण एकाग्रता और खुराक को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है, यह समय की एक छोटी राशि में अत्यधिक reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए संभव बनाने. प्रयोग मात्रात्मक, प्रदर्शन करने में आसान है, और मेजबान कारकों है कि रोगज़नक़ मांयता को प्रभावित करने के लिए स्क्रीन पर लागू किया जा सकता है, और मंजूरी ।

Introduction

जन्मजात प्रतिरक्षा सुरक्षा रोगजनक रोगाणुओं के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में । इन प्रतिक्रियाओं कार्यात्मक humoral और सेलुलर सहज प्रतिरक्षा में विभाजित किया जा सकता है, दोनों जिनमें से germline द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं-इनकोडिंग पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) कि नब्ज रोगज़नक़-जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs)1. सिग्नलिंग के कई मार्ग और प्रभावकारिता तंत्र जन्मजात प्रतिरक्षा के स्तनधारियों में संरक्षित कर रहे हैं और इस तरह के सूत्रकृमि, Caenorहैबडाइटिस एलिगेंस , और फल मक्खी, Drosophila melanogaster2के रूप में अकशेरों । फल मक्खी3संक्रामक सूक्ष्मजीवों के खिलाफ मेजबान रक्षा अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली के रूप में उभरा है । Drosophila आनुवंशिक रूप से tractable है, आसानी से और सस्ते प्रयोगशालाओं में मागणी, और एक छोटी पीढ़ी के समय है । इसके अलावा, फल मक्खी रोगाणुओं की एक सरणी के खिलाफ अत्यधिक कुशल सुरक्षा दर्शाती है, वायरल, बैक्टीरियल, कवक, या परजीवी रोगज़नक़े के खिलाफ मेजबान प्रतिरक्षा की परीक्षा को सक्षम करने ।

Drosophila इम्युनिलॉजिस्ट ऐतिहासिक रूप से आगे आनुवंशिक स्क्रीन, जीनोम चौड़ा आरएनए मध्यस्थता हस्तक्षेप (rna) कीट कोशिका लाइनों की स्क्रीनिंग का उपयोग किया है, और पूर्व मौजूदा उत्परिवर्ती मक्खी उपभेदों सहज प्रतिरक्षा की जांच करने के लिए अग्रणी- पहचान और कई विकासवाद के लक्षण वर्णन humoral प्रतिरक्षा रास्ते4,5,6,7,8। Humoral सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, यकीनन, सबसे अच्छा फल मक्खियों में प्रतिरक्षा रक्षा की विशेषता है । संक्रमण के बाद, humoral प्रतिक्रिया hemolymph में रोगाणुरोधी पेप्टाइड (AMP) अणुओं के उत्पादन और प्रणालीगत रिहाई की ओर जाता है, कीड़े में रक्त के बराबर. AMPs अत्यधिक संरक्षित टोल और आईएमडी सिग्नलिंग मार्ग द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । टोल मार्ग स्तनधारी TLR/IL-1R रिसेप्टर सिग्नलिंग के लिए समजात है, और आईएमडी मार्ग एक स्तनधारी ट्यूमर परिगलन फैक्टर-अल्फा सिग्नलिंग के लिए समजातीय है । ड्रोसोफिला में, टोल सिग्नलिंग ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया, कवक, और ड्रोसोफिला एक्स वीरुएस6,9,10 और आईएमडी सिग्नलिंग द्वारा प्रेरित किया जाता है ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया11 ,12.

सेलुलर प्रतिरक्षा, encapsulation के शामिल, मेलानीकरण, और आक्रामक रोगजनकों के phagocytosis, विशेष रक्त कोशिकाओं द्वारा किए गए hemocytes13बुलाया । फल मक्खी में hemocytes के तीन वर्गों रहे हैं: क्रिस्टल कोशिकाओं, पटलीय, और plasmatocytes13. क्रिस्टल कोशिकाओं, जो लार्वा में परिसंचारी hemocytes के 5% बनाने के लिए, जारी proPhenoloxidase (proPO) एंजाइम रोगजनकों और मेजबान ऊतकों के मेलानीकरण के लिए अग्रणी घाव साइटों पर. लैम्लोसाइट्स, जो सामान्य रूप से स्वस्थ भ्रूण या लार्वा में नहीं पाए जाते हैं, वे आसंन कोशिकाएं होती हैं जो विदेशी वस्तुओं को संपुटित करती हैं । इन कोशिकाओं को प्यूप्रिएशन पर प्रेरित किया जाता है या जब लार्वा में परजीवी तसला अंडे जमा होते हैं । फेगोसाइटिक plasmatocytes, जो लार्वा में परिसंचारी hemocytes के ९५% बनाने के लिए और वयस्कों में सभी शेष hemocytes, विकास के दौरान ऊतक remodeling में एक भूमिका निभाते है और विशेष रूप से, Drosophila सेलुलर प्रतिरक्षा के मुख्य effector सेल के रूप में सेवा करते हैं ।

फैगोसाइटोसिस जन्मजात प्रतिरक्षा रक्षा की एक तत्काल और महत्वपूर्ण लाइन; रोगाणुओं है कि उल्लंघन मेजबान उपकला बाधा जल्दी से घिरा हुआ है और भॉगोसाइटिक रक्त कोशिकाओं द्वारा सफाया (भगोशितोसिस के सेल जीव विज्ञान की एक व्यापक समीक्षा के लिए संदर्भ देखें 14) । यह प्रक्रिया शुरू की जाती है जब जर्मलाइन-एनकोडेड पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) hemocytes पर रोगाणु संबंधित आणविक पैटर्न (PAMPs) माइक्रोब्स की पहचान. एक बार अपने लक्ष्य के लिए बाध्य, prrs cascades संकेत है कि ऐक्टिन cytoskeleton remodeling के माध्यम से स्यूडोपॉड्स के गठन के लिए नेतृत्व शुरू । स्यूडोपॉड सूक्ष्मजीव को घेर लेते हैं, जिसे बाद में झंकृत किया जाता है और एक नवजात अंगक में भली भांति किया जाता है । रोगाणु नष्ट हो जाते हैं क्योंकि फेगोसोम फेगोसोम की प्रक्रिया से गुजरता है, जब फेगोसोम रक्तकोशिका के आंतरिक भाग की ओर तस्करी करता है और लाइसोसोम के साथ बातचीत की एक श्रृंखला के माध्यम से acidifies । विट्रो और सेल में जीव विज्ञान के अध्ययन में स्तनधारी प्राथमिक कोशिकाओं की पहचान करने और कारक है कि इस तरह के स्तनधारी एफसी-गामा रिसेप्टर और C3b रिसेप्टर्स15,16के रूप में phagocytosis, को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । फिर भी, बड़े पैमाने पर स्क्रीन या vivo अध्ययन में निष्पादित करने की क्षमता स्तनधारी सिस्टम में सीमित हैं ।

यहां हम एक वयस्क फल मक्खियों, जो पहली २०००17में डेविड Schneider की प्रयोगशाला द्वारा शुरू की प्रक्रिया पर आधारित है में phagocytosis के लिए vivo परख में मौजूद है । Schneider प्रयोगशाला से पता चला कि seसीले hemocytes पेट पृष्ठीय पोत के साथ संकुल आसानी से phagocytose polystyrene मोती और बैक्टीरिया । फगोसाइटोसिस कल्पना करने के लिए, मक्खियों प्रतिदीप्ति लेबल कणों के साथ इंजेक्शन कर रहे हैं (जैसे ई. कोलाई के साथ लेबल फ्लोरेसेइन आइसोथायोसायनेट (ई.कोलाई-fitc)), 30 मिनट के लिए इनक्बल्ड करने के लिए hemocytes समय कणों निगल करने के लिए अनुमति देते हैं, और फिर ट्राइपैन ब्लू के साथ इंजेक्ट किया जाता है, जो इनक्यूबेशन अवधि के दौरान कणों की प्रतिदीप्ति को नहीं फैलाए । मक्खी पृष्ठीय जहाजों तो एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर imaged हैं । यह लाभदायक कागज, एक अपेक्षाकृत सरल प्रयोग का उपयोग करते हुए, प्रदर्शन किया है कि hemocytes फैगोसाइटोज बैक्टीरिया और लेटेक्स मोती, कि जीवाणु भक्षककोशिका पूर्व से हिचकी जा सकता है लेटेक्स मोती के साथ मक्खियों इंजेक्शन, और है कि दोनों सेलुलर और humoral बिना मक्खियों प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को भी ई.कोलाई के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । इस रिपोर्ट में प्रस्तुत परख Schneider लैब के काम पर बनाता है विवो phagocytosis में पृष्ठीय पोत से घिरा हुआ कणों की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा निर्धारित hemocytes ।

स्तनधारी प्रणालियों में लिया दृष्टिकोण के समान, drosophila आनुवंशिकी शुरू में जीनोम चौड़ा इस्तेमाल किया विट्रो rnai स्क्रीन में सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए18,19,20 ,21,22,23. हालांकि, vivo phagocytosis परख में वयस्क के विकास के अनुवर्ती प्रयोगों को आसानी से पूरे जानवरों में किया जा सक्षम है, इस प्रकार शोधकर्ताओं जैविक विट्रो अध्ययन में पहचान कारकों की भूमिका को सत्यापित करने की अनुमति । इस तरह के साथ मामला था ट्रांस्मेल् ड रिसेप्टर आदमखोर, जो पहली बार एक RNAi स्क्रीन में एक जीवाणु ग्राही के रूप में पहचान की गई S2 की कोशिकाओं का उपयोग कर24 और फिर बाद में मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया escherichia कोलाई (ई.कोलाई), enterococcus फेकैलिस, और स्टैफिलोकोकस ऑरियस (एस. ऑरियस) वयस्कों में फगोसाइटोसिस25.

हमारे प्रयोगशाला आगे आनुवंशिक स्क्रीन और जीनोम व्यापक एसोसिएशन के अध्ययन में vivo phagocytosis परख में कार्यरत ( Drosophila आनुवंशिक संदर्भ पैनल (dgrp) का उपयोग कर) उपंयास जीन है कि वयस्क hemocytes में phagocytosis को विनियमित की पहचान । इन अध्ययनों के लक्षण वर्णन रिसेप्टर्स PGRP-SC1A और PGRP-एसए26, intracellular आशय के अवैध व्यापार Rab1427, ग्लूटेमेट ट्रांसपोर्टर polyphemus28, और आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन फॉक्स-129के लिए नेतृत्व किया ।

हमें आशा है कि भविष्य vivo भगोसाइटोसिस में शामिल स्क्रीन अतिरिक्त जीन है कि Drosophilaमें सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है की पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकता है । इस तरह के dgrp या drosophila सिंथेटिक जनसंख्या संसाधन (dspr) के रूप में पूरी तरह से sequenced अंत: प्रजात लाइनों, का उपयोग कर स्क्रीन, phagocytosis या hemocyte विकास को प्रभावित करने वाले प्राकृतिक वेरिएंट की पहचान कर सकते हैं । इसके अलावा, तकनीक drosophila की अन्य प्रजातियों में अपनाया जा सकता है या इस तरह के २५० drosophila प्रजातियों के संग्रह के रूप में नए समुदाय संसाधनों, स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया राष्ट्रीय Drosophila प्रजाति स्टॉक सेंटर द्वारा बनाए रखा (ndssc ) कॉर्नेल में । इन प्रयोगों से बाहर किया जा सकता है प्रतिदीप्ति-लेबल जीवाणु या कवक दीवार bioparticles कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है या जीवाणु या कवक प्रजातियों में से किसी भी संख्या का उपयोग किया जा सकता है-बशर्ते कि सूक्ष्म जीव फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त .

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Protocol

1. इंजेक्शन के लिए फ्लोरेसेइन कणों को तैयार करें

  1. 10 मिलीग्राम वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध की, गर्मी में मारे गए बैक्टीरिया फ्लोरेसइन के साथ लेबल कणों ( सामग्री की तालिकादेखें) ९९० μl बाँझ 1X pbs और 10 μl ५० mM सोडियम azide जोड़कर 10 मिलीग्राम/मिलीलीटर की एक शेयर एकाग्रता के लिए पुन: गठित । मिश्रण करने के लिए भंवर ।
    1. प्रकाश संबद्ध संवेदनशीलता को कम करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे बॉक्स में ०.२ मिलीलीटर ट्यूबों और स्टोर में एकल उपयोग 8 μL aliquots में विभाजित ।
      नोट: सोडियम ऐज़ाइड परिरक्षक वैकल्पिक है और यदि 10 मिलीग्राम/मिलीलीटर स्टॉक 1 मिलीलीटर बाँझ 1x pbs, aliquoted, और-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत के साथ किया जाता है लोप किया जा सकता है ।
  2. एक 10 मिलीलीटर समाधान बनाने के 5% खाद्य 1x PBS में रंग भरने ५०० μL सिरिंज फ़िल्टर्ड हरी खाद्य रंग और ९.५ मिलीलीटर बाँझ 1x PBS.
  3. सोडियम azide को दूर करने के लिए इंजेक्शन से पहले धो कणों । मिश्रण ४२ μL बाँझ 1x PBS और 8 μL के 10 मिलीग्राम/एमएल में एक १.७ मिलीलीटर ट्यूब. कमरे के तापमान पर २.५ मिनट के लिए अधिकतम गति पर सेंट्रीफ्यूज ।
    1. Supernatant निकालें, ५० μL 1x PBS जोड़ें, और कमरे के तापमान पर २.५ मिनट के लिए अधिकतम गति पर सेंट्रीफ्यूज ।
    2. दोहराएं चरण १.३ और 1.3.1 2x, की कुल के लिए 3 washes ।
    3. अंतिम धोने के बाद, supernatant छोड़ें और 1 x PBS में 5% भोजन रंग के ५० μL में १.६ मिलीग्राम/एमएल के कणों फिर से निलंबित ।
    4. एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब लपेटें प्रकाश से बचाने के लिए । 4 ° c पर स्टोर करें, 1 सप्ताह के बाद छोड़ें ।

2. इंजेक्शन स्टेशन और मक्खियों को तैयार

  1. इंजेक्शन पैड तैयार करें । एक ही समय में मक्खियों के 4 जीनोटाइप करने के लिए इंजेक्शन, एक आयताकार सह2 मक्खी पैड 4 वर्गों में विभाजित करने के लिए प्रयोगशाला टेप का उपयोग करें । खुर्दबीन के पास बेंच पर, क्षेत्रों को नामित करने के लिए एक बार मक्खियों को पैड पर लाइन में खड़ा कर दिया गया है (पैड के प्रत्येक कोने के लिए एक) ।
  2. उम्र-मिलान, 4-7 दिन-पुराने, इंजेक्शन के लिए मक्खियों की विल्स तैयार करते हैं । प्रत्येक तनाव के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए, 5 पुरुषों और 5 महिलाओं के एक ताजा, लेबल तैयार मक्खी भोजन में और 25 डिग्री सेल्सियस पर रखने में स्थानांतरण ।
  3. वायवीय सुई लगानेवाला तैयार ( सामग्री की मेजदेखें) एक १०० ms के लिए साधन की स्थापना के द्वारा (गैस के दबाव के कम फटने तरल निष्कासित करने के लिए-उप नैनोलीटर मात्रा के वितरण की अनुमति) समय पर मोड ।
  4. माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें । कट १.५-बिजली के टेप के इंच स्ट्रिप्स, चिपकने वाला बाहर की ओर के साथ एक पाश में गुना, और एक लेबल माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जगह है ।

3. कांच केशिका सुई तैयार

  1. एक सुई खींचने का उपयोग कांच सुई (पतली दीवार ग्लास capillaries) खींचो ।
    1. माइक्रोमीटर के साथ खुर्दबीन के नीचे सुई पकड़ो और #5 ठीक बात स्टेनलेस स्टील चिमटी का उपयोग टिप तोड़ । १०० μm युक्तियां है मक्खी छल्ली घुसाना जबकि घाव को ंयूनतम करने के लिए पर्याप्त हैं ।
    2. तरल पदार्थ है कि प्रत्येक मक्खी में इंजेक्ट किया जाएगा की मात्रा को मापने । बाँझ के साथ सुई लोड 5% 1x PBS में रंग भरने वाली खाद्य और एक ०.०१ मिमी चरण micrometer पर खनिज तेल की एक बूंद पर तरल निष्कासित ।
      नोट: यदि तरल छोटी बूंद गोलाकार है, picoliters में मात्रा (आकार)3/१९१० के रूप में गणना की है । 30 एक सुई १०० μm व्यास के साथ १०० ms में ~ 2 nL बाहर निकाल देंगे ।

4. मक्खियों सुई

  1. पिपेट 10 μL १.६ मिलीग्राम/मिलीलीटर कणों के एक छोटे वर्ग पर parafilm ।
    1. सुई में तरल खींचो और इंटैक्टर नोक में माउंट ( सामग्री की मेजदेखें) ।
    2. 2 CO के साथ anesthetize मक्खियों और उंहें लाइन ऊपर flypad पर उनके नामित क्षेत्र में, अधर पक्ष के साथ और पैड के सामने की ओर उंमुख सिर । बेंच पर संबंधित क्षेत्रों में जगह की विल्स ।
    3. तरल के 5, १०० एमएस पंपों के साथ पेट के ऊपरी कोने में मक्खियों सुई (~ 10 nL कुल) ।
    4. इंजेक्शन मक्खी उपयुक्त शीशियों के लिए स्थानांतरण, शीशी पर समय ध्यान दें । 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
  2. ०.४% Trypan ब्लू समाधान के साथ एक नई सुई लोड ।
  3. GATEDकरने के लिए वायवीय सुई लगानेवाला सेट, जो हवा की एक निरंतर प्रवाह की अनुमति देता है तरल पुश करने के लिए सुई से बाहर.
  4. Anesthetize मक्खियों के बाद वे 30 मिनट के लिए विश्राम किया है और Trypan नीले रंग के साथ सुई जब तक पेट भरा हुआ है और distended ।
    नोट: जब pH-संवेदी डाई के साथ लेबल किए गए कणों के साथ फेगोकुछ परिपक्वता की जांच की जाती है, तो मक्खियों को 1 ज के लिए आराम करने की अनुमति दें और बढ़ते मक्खियों से पहले ट्राईपैन ब्लू के साथ सुई न करें ।
  5. माउंट बिजली के टेप, अधर साइड नीचे के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर मक्खियों । मक्खी के पक्ष में पंख पुश और उन्हें टेप करने के लिए सुरक्षित । इसके अलावा, धीरे से टेप में सिर पुश करने के लिए सुनिश्चित करें कि मक्खी कदम नहीं होगा ।
  6. तुरंत चरण 5 पर जाएं ।

5. इमेजिंग मक्खियों

  1. छवि मक्खियों, एक समय में एक, 25x या 32x में एक व्युत्क्रम प्रतिदीप्ति एक डिजिटल कैमरा और कंप्यूटर से जुड़ी माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ( सामग्री की मेजदेखें) । डिजिटल कैमरे के लिए कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मक्खी के पृष्ठीय पोत पर ध्यान केंद्रित करें ।
  2. एक्सपोज़र समय और प्रयोगों के बीच आवर्धन रिकॉर्ड करें ।
    नोट: जीनोटाइप का ट्रैक खोने त्रुटि का एक संभावित स्रोत है जब एक एकल बैठे में एकाधिक उपभेदों छायाचित्रण । Mislabeling मक्खियों से बचने के लिए, प्रत्येक जीनोटाइप के लिए पहली और आखिरी मक्खी तस्वीर की छवि संख्या का एक नोट बनाओ ।

6. Quantifying और प्रतिदीप्ति को सामान्य

  1. सॉफ़्टवेयर खोलें और एक बार में एक छवि खोलें ।
    1. पृष्ठीय वाहिका की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने. पृष्ठीय पोत के चारों ओर एक बहुभुज ड्रा । उपाय का चयन करें और बहुभुज के अंदर प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकॉर्ड.
    2. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण । पहले बहुभुज की प्रतिलिपि बनाएँ और इसे मक्खी के पृष्ठीय पोत के निकट के क्षेत्र में ले जाएँ । पृष्ठभूमि क्षेत्र की माप और रिकॉर्ड प्रतिदीप्ति तीव्रता का चयन करें ।
    3. पृष्ठीय पोत प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति द्वारा सामान्य:
      पृष्ठीय वाहिका ÷ पृष्ठभूमी.
    4. एक तनाव में सभी मक्खियों के औसत सामान्यीकृत पृष्ठीय पोत प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना करें ।
    5. प्रयोग को 2 बार दोहराएं ।
    6. नियंत्रण मक्खियों और परीक्षण मक्खियों के तीन प्रयोगों से मतलब सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना करने के लिए एक छात्र के अयुग्मित टीपरीक्षण का प्रयोग करें. सूत्र का उपयोग करके प्रभाव आकार की गणना करें: कोहेन का d = (m1-m2) ÷ SDपरित, जहाँ m1 जीनोटाइप 1 और m2 का माध्य है जीनोटाइप 2 का माध्य है &
      SD परित =Equation
      जहां SD1 जीनोटाइप 1 का मानक विचलन है और SD2 जीनोटाइप 2 का मानक विचलन है ।

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Representative Results

एक योजनाबद्ध में विवो भगोसाइटोसिस परख का उपयोग कर fluorescein-लेबल कणों चित्रा 1aमें दिखाया गया है । मक्खियों को विद्युत टेप के एक टुकड़े पर और नीचे की ओर घुड़सवार कर रहे है और पेट के पहले दो खंडों, जहां पृष्ठीय पोत स्थित है, स्पष्ट रूप से दिखाई देता है (चित्र 1b) । प्रयोगात्मक त्रुटि के प्रमुख स्रोतों इंजेक्शन और प्रक्रिया के इमेजिंग कदम (चित्रा 1 सी) में उठता । एक ही सुई का उपयोग करने के लिए कई मक्खियों सुई यह मक्खी ऊतक या कणों के साथ भरा हुआ हो सकता है ( चित्रा 1Cमें शीर्ष बाएँ पैनल). क्योंकि gfp प्रकाश के तहत drosophila ऑटो-fluoresces, मक्खियों के साथ एक भरा सुई fluoresces बेहोश हो जाएगा, लेकिन कमी hemocytes द्वारा भली भांति कणों की स्पष्ट, पंचर प्रतिदीप्ति । प्रयोगात्मक त्रुटि का एक और संभावित स्रोत Trypan नीले इंजेक्शन के दौरान हो सकता है । प्रतिदीप्ति-लेबल कणों के साथ पहला इंजेक्शन के बाद तीस मिनट, मक्खियों Trypan नीले रंग के साथ एक दूसरा इंजेक्शन प्राप्त करते हैं, जो extracellular के प्रतिदीप्ति, संयुक्त राष्ट्र phagocytosed कणों quenches. प्रत्येक मक्खी के सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना पृष्ठीय वाहिका के प्रतिदीप्ति को पेट पर समान रूप से आकार के निकटवर्ती क्षेत्र से विभाजित करके की जाती है । मक्खियों कि पर्याप्त Trypan नीले fluoresce अपने पूरे पेट भर ( चित्रा 1Cके नीचे बाएं पैनल) को प्राप्त नहीं है । इस उज्ज्वल प्रतिदीप्ति पृष्ठीय पोत के अनुपात को पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए कम कर सकते हैं, इस प्रकार जानवर की सही प्रतिदीप्ति तीव्रता अनुपात कम । अंत में, मक्खियों की तस्वीर होनी चाहिए जबकि2CO द्वारा मैटीरियल, के रूप में सक्रिय रूप से चलती मक्खियों धुँधली छवियों का उत्पादन (ऊपर और नीचे, चित्रा 1cके सही पैनलों) नहीं किया जा सकता है ।

Zuker संग्रह एथिल मेथानेस्फोनेट (ईएमएस) का एक पैनल ऑटोसोमल म्यूटेशन के साथ मक्खियों का इलाज किया है । 31 मूल रूप से २००४ में एक समुदाय संसाधन के रूप में स्थापित, लाइनों को आगे ले जाने के लिए इस्तेमाल किया गया है और आनुवंशिक स्क्रीन रिवर्स । हमारे लैब Zuker संग्रह से एक पंक्ति है कि phagocytose ग्राम नकारात्मक (ई. कोलाई K-12 तनाव) और ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया (प्रोटीन के बिनाaureus लकड़ी तनाव एक) (चित्रा 2) में असमर्थ है की पहचान की । इस उत्परिवर्ती, argusकहा जाता है, vivo phagocytosis परख में में लगभग कोई पृष्ठीय पोत प्रतिदीप्ति से पता चलता है । जब zuker समजीनी पृष्ठभूमि तनाव, cn bwकी तुलना में, argus ई. कोलाई के काफी कम उत्साहित दिखाता है (पी-मूल्य = ०.०१९; कोहेन के डी = १.६७७) और एस. ऑरियस (पी-वैल्यू = ०.००८३; कोहेन के डी = १.६७२) । ई. कोलाई (p-value = ०.०४५; आर्गस बैक्टीरियल फैगोसाइटोसिस भी काफी बिगड़ा हुआ है । कोहेन के डी = ०.८५०) और एस. ऑरियस (पी-वैल्यू = ०.०१३६; कोहेन के डी = १.४२२) जब एक और आम प्रयोगशाला नियंत्रण तनाव, canton-एस की तुलना में ।

Figure 1
चित्रा 1: अवलोकन और विवो भगोसाइटोसिस परख के प्रतिनिधि छवियां । A. vivo में की योजनाबद्ध phagocytosis परख fluorescein-लेबल कणों का उपयोग कर । दो इंजेक्शन, 30 मिनट के अलावा, कण मांयता कल्पना और पृष्ठीय पोत द्वारा उत्साहित रक्त कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है । ख. सफेद प्रकाश एक मक्खी टेप पर घुड़सवार दिखा, स्पष्ट रूप से दिखाई पूर्वकाल उदर क्षेत्रों के साथ । C. वीवो फेगोसाइटोसिस छवियों में उदाहरण । (ऊपर बाएं) एक भरा हुआ सुई के साथ एक मक्खी इंजेक्शन कोई कण प्रतिदीप्ति है । (निचला बायां) अपर्याप्त ट्राइपैन ब्लू के कारण उच्च कोशिकाकोशिकीय प्रतिदीप्ति के साथ एक मक्खी। (ऊपर दाएं) कोई extracellular प्रतिदीप्ति के साथ एक स्थिर मक्खी-आदर्श छवि । (नीचे दाईं ओर) सह के रूप में चलती मक्खी2 बेहोशी पहनता है एक blurry छवि बनाता है । स्केल बार, ०.२ मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: उत्परिवर्ती और नियंत्रण मक्खियों में बैक्टीरिया की भस्त्रता । A. फ्लोरेसेइन डाई के साथ लेबल फैगोसाइटोसिस बैक्टीरिया के प्रतिनिधि छवियां; ई. कोलाई (शीर्ष पैनलों) और एस aureus (नीचे पैनलों) । B. मक्खियों की प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुपात फ्लोरेसेइन-ई. कोलाई कणों के साथ अंतःक्षिप्त होता है । ( ग ) मक्खियों की प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुपात फ्लोरेसेइन-एस-ऑरियस कणों के साथ अंतःक्षिप्त होता है । n = 3 बैक्टीरिया के प्रत्येक प्रकार के लिए प्रयोग करते हैं, के साथ 6-8 प्रति मक्खियों । त्रुटि पट्टियां, ± SEM. सांख्यिकीय विश्लेषण = द्वि-पुच्छ t-परीक्षण । स्केल बार, ०.२ मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध है, प्रतिदीप् त लेबल कणों सामान्य (०.२ μm कार्बोक्सिलेट-संशोधित microspheres) या रोगाणुओं की phagocytosis (प्रतिदीप् ति-लेबल गर्मी-या रासायनिक रूप से मारे गए बैक्टीरिया या खमीर) में भगोसाइटोसिस का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है । Phagosome परिपक्वता का आकलन करने के लिए, शोधकर्ताओं ने एक पीएच-संवेदनशील डाई के साथ लेबल कणों का चयन कर सकते हैं कि फ्लोरेज़ जब पीएच तटस्थ से अम्लीय करने के लिए कम हो जाती है, के रूप में phagolysosome में. वैकल्पिक रूप से, phagocytosis के प्रारंभिक चरणों की जांच करने के लिए, रोगज़नक़ मान्यता और उत्साहित, शोधकर्ताओं फ्लोरोसेंट टैग के साथ लेबल कणों का चयन करना चाहिए कि अंदर और कोशिकाओं के बाहर fluoresce.

ध्यान से नियंत्रित प्रयोगात्मक स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए कुंजी है vivo phagocytosis परख में एक reproducible तरीके से किया जाता है । सबसे पहले, Drosophila सेलुलर immunosenescence३२, तो प्रयोग में इस्तेमाल मक्खियों उम्र मिलान किया जाना चाहिए, 4-7 दिन पुराने की एक सीमा के भीतर बेहतर है । दूसरा, इंजेक्शन के बीच की अवधि सुसंगत होना चाहिए । फेगोसाइटोसिस तेजी से होता है, मेजबान सेल सूक्ष्म जीव14संवेदन के मिनट के भीतर । अगले एक घंटे में, phagosome परिपक्वता जगह लेता है, फेगोज़ के अलीकरण और भली भांति microbe के विनाश के लिए अग्रणी । इंजेक्शन के बीच प्रतीक्षा करने के लिए एक सेट अंतराल Designating प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता कम कर देता है और तुलना करने के लिए विभिंन दिनों पर आयोजित उपभेदों और प्रयोगों के बीच किया जा करने के लिए । हम तीस मिनट इंतज़ार कर जब fluorescein कणों का उपयोग कर और एक घंटे के लिए vivo phagosome परिपक्वता परख pH-संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल कणों का उपयोग कर सलाह देते हैं ।

एक ही सुई का उपयोग करने के लिए कई उपभेदों सुई सुनिश्चित करता है कि सभी मक्खियों कणों और प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता की एक ही खुराक प्राप्त अगर गिलास सुई तोड़ या भरा हो सकता है उत्पन्न कर सकते हैं. तो, इंजेक्शन स्टेशन की स्थापना और पहले से मक्खियों को सुनिश्चित करना है कि vivo phagocytosis परख में जल्दी और कुशलता से किया जाता है की कुंजी है । प्रयोग शुरू करने से पहले, कई सुइयों से निष्कासित तरल की मात्रा को मापने और एक ही आकार की सुई का एक सेट बनाए रखने । इस प्रकार, यदि एक सुई इंजेक्शन के बीच टूट जाता है, यह तुरंत प्रतिस्थापित किया जा सकता है । इसके अलावा, भरा सुई झूठी नकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, यह मुश्किल मक्खियों जिसके hemocytes के बीच भेद करने के लिए नहीं कर रहे हैं phagocytose रोगाणुओं और मक्खियों कि फ्लोरोसेंट कणों प्राप्त नहीं किया. डाई समाधान हरे रंग के भोजन के साथ बनाया, यह आसान है जो मक्खियों को ट्रैक करने के लिए इंजेक्शन दिया गया है और भरा हुआ सुई के साथ मुद्दों की पहचान करने के लिए बनाते हैं । आदर्श रूप में, प्रयोग एक से अधिक बार किया जाना चाहिए, प्रत्येक प्रयोग में तनाव के प्रति कम 6-8 मक्खियों के साथ, और प्रयोगों के परिणामों की पहचान के लिए outliers की तुलना में । अंत में, पर्याप्त Trypan नीले पूरी तरह से extracellular कणों की प्रतिदीप्ति इतनी है कि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मक्खियों के बीच तुलनीय है (चित्रा 1 सी) बुझाने के लिए प्रशासित किया जाना चाहिए ।

जब इमेजिंग मक्खियों, देखभाल भी पृष्ठीय पोत के स्पष्ट, सुसंगत छवियों को प्राप्त करने के लिए लिया जाना चाहिए । काले विद्युत टेप एक अंधेरे पृष्ठभूमि बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है और मक्खियों उनके पंख और टेप के चिपकने वाला पक्ष को सुरक्षित सिर के साथ, अधर पक्ष नीचे माउंट किया जाना चाहिए । यदि संभव हो तो मक्खियों को सह2 के तहत मैटीरियल रहना चाहिए जबकि छवियां ली जाती हैं । अंत में, प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह की संभावना को सीमित करने के लिए, हम एक अंधा प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग करने की सलाह देते हैं; जहां विल्स और उपभेदों एक शोधकर्ता द्वारा कोडित किया जाता है और प्रयोग किया जाता है और एक और शोधकर्ता द्वारा मात्रा निर्धारित ।

Vivo phagocytosis परख में एक उपयोगी उपकरण है phagocytosis में वैश्विक दोषों की पहचान । हालांकि, यह hemocyte फैगोसाइटोसिस दक्षता और hemocyte संख्या या स्थान में मतभेदों के बीच अंतर नहीं है, उम्र से संबंधित गिरावट या विकासात्मक दोषों के कारण. ३२ इसके अलावा, प्रक्रिया के आकार या व्यक्तिगत hemocytes की भक्षककोशिका क्षमता में अंतर के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है । इस प्रकार, एक बार के साथ मक्खियों कम भगोसाइटोसिस का उपयोग पहचान किया गया है vivo phagocytosis परख में, शोधकर्ताओं ने बाहर का पालन अध्ययन करना चाहिए, शायद वैकल्पिक कणों का उपयोग कर, के बीच भेदभाव करने के लिए प्रतिरक्षा से संबंधित phagocytosis दोषों और सामान्य भगोशी दोष । अंत में, आणविक तंत्र का निर्धारण कि उत्परिवर्ती उपभेदों में भभका भकोरक दोष एकल hemocytes में phagocytosis की एक परीक्षा की आवश्यकता है । इस का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, संनाभि माइक्रोस्कोपी, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटाई या वयस्क hemocytes के चुंबकीय मनका अलगाव27,28,29,३२,३३ , ३४.

कुल मिलाकर, Drosophila जीवित पशुओं में सहज प्रतिरक्षा अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी मॉडल साबित हो गया है । यहां हम में से एक सिंहावलोकन प्रदान की है vivo phagocytosis परख, एक विधि का अध्ययन करने के लिए वैश्विक भगोसाइटोसिस और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में वयस्क मक्खियों । प्रक्रिया नए जीन है कि मेजबान रक्षा के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है के लिए स्क्रीन पर लागू किया जा सकता है, विट्रो rnai स्क्रीन में बड़े पैमाने में पहचान जीन मांय, और आगे humoral, आंत या एंटीवायरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में दोषों के साथ म्यूटेंट विशेषताएं । यह सेट अप करने के लिए आसान है और समय की एक छोटी राशि में मक्खियों के कई उपभेदों के बारे में विश्वसनीय डेटा की एक बड़ी राशि उपज कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने वीवो फैगोसाइटोसिस प्रयोगों में ले जाने में सहायता के लिए डॉ बेथ गोंजालेज और डॉ अपरजिता गर्ग का धन्यवाद । एक NSF UMD अग्रिम बीज अनुदान और UMD NIH T32 प्रशिक्षण अनुदान, सेल और आणविक जीव विज्ञान (CMB) और मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत (HPI), इस काम के वित्त पोषित ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres Invitrogen F8810 Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit World Precision Instruments 5430-10 Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen E13231 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen E23370 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2861 Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen P35361 Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen A10010 Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820 World Precision Instruments SYS-PV820 The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen S23371 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen S23372 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2851 Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW100F-3 Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma T8154 Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) Zeiss SteREO Discovery.V8 Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Z23373 Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen Z23374 Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen Z2841 Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red Invitrogen Z2843 Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)

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फल मक्खी, <em>Drosophila melanogaster</em>के सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन, Vivo Phagocytosis परख में एक का उपयोग
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Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay. J. Vis. Exp. (146), e59543, doi:10.3791/59543 (2019).

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