Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bedömning av Lymfocytmigration i ett transmigrations system ex vivo

Published: September 20, 2019 doi: 10.3791/60060
Automatic Translation
1,3, 2,3,4
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

Summary

I detta protokoll är lymfocyter placeras i den övre kammaren i ett transmigration system, separerade från botten kammaren av ett poröst membran. Chemokine läggs till botten kammaren, som inducerar aktiv migration längs en Chemokine lutning. Efter 48 h räknas lymfocyter i båda kamrarna för att kvantifiera transmigration.

Abstract

Häri presenterar vi en effektiv metod som kan utföras med grundläggande laboratorie kunskaper och material för att bedöma lymfocytkemokinetiska rörelser i ett transmigrations system ex vivo. Grupp 2 medfödda lymfoida celler (ILC2) och CD4+ T Helper celler isolerades från mjälte och lungor av kyckling ägg äggalbumin (ova)-ifrågasatte Balb/c möss. Vi bekräftade uttrycket av CCR4 på både CD4+ T-celler och ILC2, jämförelsevis. CCL17 och CCL22 är de kända liganderna för CCR4; Därför, med hjälp av denna ex vivo transmigration metod undersökte vi CCL17- och CCL22-inducerad förflyttning av CCR4+ lymfocyter. För att fastställa Chemokine gradienter, CCL17 och CCL22 placerades i botten kammaren av transmigration systemet. Isolerade lymfocyter lades sedan till översta kamrarna och över en 48 h period lymfocyter aktivt migreras genom 3 μm porer mot Chemokine i botten kammaren. Detta är ett effektivt system för bestämning av chemokinetik av lymfocyter, men, förståeligt, inte efterlikna de komplikationer som finns i in vivo organ mikromiljöer. Detta är en begränsning av den metod som kan övervinnas genom tillsats av in situ-avbildning av det organ och de lymfocyter som studeras. Fördelen med denna metod är däremot att den kan utföras av en tekniker på ingångsnivå med en mycket mer kostnadseffektiv hastighet än Live Imaging. Som terapeutiska föreningar blir tillgängliga för att förbättra migration, som i fallet med tumör infiltrerande cytotoxiska immunceller, eller att hämma migration, kanske i fallet med autoimmuna sjukdomar där immunopatologi är oroande, denna metod kan användas som en screening verktyg. I allmänhet är metoden effektiv om Chemokine av intresse konsekvent genererar chemokinetics på en statistiskt högre nivå än Media kontroll. I sådana fall kan graden av hämning/förbättring av en viss förening bestämmas också.

Introduction

Denna ursprungliga transmigration metod presenterades av Stephen Boyden i 1962 i Journal of experimental Medicine1. Mycket av vad vi vet om chemotaxis och chemokinetics skulle inte vara möjligt utan utvecklingen av Boyden kammaren. Före upptäckten av den första Chemokine i 1977, ex vivo transmigration system användes för att lära sig om serum-faktorer som kan gripa cellulära rörligheten i makrofager samtidigt förstärka cellulära motilitet i neutrofiler1,2. En massiv rikedom av kunskap har utvecklats när det gäller immun cell migration, och hittills har 47 chemokiner nu upptäckts med 19 motsvarande receptorer3,4. Dessutom, mängder av hämmare/förstärkare av dessa Chemokine vägar har genomgått utveckling för terapeutiska ändamål5,6,7,8. Många av dessa föreningar har testats i liknande transmigration kammare för att förstå direkt interaktion mellan föreningarna och immuncellernas reaktionsförmåga till en given Chemokine9.

Transmigration, eller diapedesis, till inflammerad vävnad är en viktig process för att en hälsosam inflammatorisk reaktion på klar infektion10,11. En Boyden kammare, transmigration system, eller transwell apparater är i allmänhet består av två kammare åtskilda av ett poröst membran1,12. Botten kammaren oftast innehar media som innehåller Chemokine av intresse, medan leukocyter placeras i den övre kammaren. Storleken på pore i membranet kan väljas baserat på storleken på den cell av intresse. För detta projekt valde vi ett 3 μm poröst membran, eftersom lymfoida celler är 7-20 μm i storlek, beroende på stadiet av cellulära utveckling. Denna porstorlek säkerställer att dessa celler inte passivt faller genom porerna, men att de aktivt migrerar som svar på Chemokine lutning.

Den stora fördelen med detta protokoll är dess kostnadseffektivitet. In vivo transmigration är svårt eftersom det kräver omfattande utbildning i djurhantering och kirurgi, och ofta innebär hög driven mikroskopi som inte alltid är tillgänglig för en forskare. Kostnadseffektiv screening av föreningar som tros förbättra eller hämma transmigration kan åstadkommas i förväg av in vivo Imaging. Eftersom transmigration systemet är tätt kontrollerad, celler kan behandlas initialt sedan läggas till transwell apparaten, eller vice versa, Chemokine kan behandlas först med en Chemokine hämmare sedan celler läggas till transwell apparaten. Slutligen, endotelceller och/eller basalmembran proteiner kan läggas till botten av transwell infoga 1-2 dagar före transmigration experimentet att förstå inblandning av dessa barriär celler i chemokinetics. Återigen, dessa manipulationer av systemet ger ett kraftfullt sätt att fastställa viktig information om effektiviteten av en given förening i förväg av mer komplicerade in vivo studier.

Att använda ett transmigrations kammar system är ett effektivt sätt att bedöma lymfocytrörligheten under olika in vivo-och in vitro-villkor12,13,14. Häri, beskriver vi en optimerad metod för att bedöma ex vivo lymfocytreaktionsförmåga till chemokiner i en transmigration kammare. I detta exempel experiment, CD4+ T-celler och grupp 2 medfödda lymfoida celler (ILC2) isolerades från manliga och kvinnliga, Balb/c möss efter OVA-allergen exponering. En hypotes genererades att CCR4+ CD45+ Lineage-(LIN-) ILC2 från allergen-utmanade möss skulle MIGRERA mer effektivt mot CCL17 och CCL22 än CCR4+ CD4+ T Helper celler. CCL17 och CCL22 är chemokines vanligen produceras av dendritiska celler och makrofager av m2 (allergisk) fenotyp, bland andra celler, i allergi15,16. CCL17 och CCL22 kan betraktas som biomarkörer för allergisk inflammation eftersom de lätt upptäcks i lungorna under luftvägarna exacerbationer16,17,18. Viktigt, CCR4 uttrycket är förhöjd i jämförelse med obehandlade kontroller, som avslöjas i bioinformatiska data som genereras från ILC2 isolerade från hus dammkvalster behandlade djur, och likaså ILC2 från naiva djur behandlade ex vivo med IL-33 ( allergen-främja medfödda cytokin) uppreglerar CCR419,20. Dessutom, enligt uppgifter för ILC2 i den immunologiska genomprojektet databas (www.immgen.org), CCR4 mRNA är starkt uttryckt i dessa medfödda immunceller. Hittills är lite känt om handel med ILC2 i vävnader, men det är troligt att ILC2 och CD4+ T-celler använder liknande chemokines och receptorer för chemotaxis och chemokinetics som de uttrycker liknande transkriptionsfaktorer och receptorer. Således jämförde vi CCL17 kontra CCL22 lyhördhet, av ILC2 och CD4+ T-lymfocyter, från både manliga och kvinnliga, OVA-utmanade djur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här granskades och godkändes av den institutionella djuromsorg och använda kommittéer vid University of Nebraska Medical Center (UNMC) och University of Utah.

1. inställning och beredning av reagenser

  1. Förbered komplett RPMI (Roswell Park Memorial Institute) media.
    1. Tillsätt 10 mL värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) till 90 mL RPMI.
    2. Tillsätt 1 mL 100x penicillin-streptomycin-glutamin till 100 mL 10% FBS RPMI.
  2. Förbered ILC2 expansions medium.
    1. Tillsätt IL-2 och IL-33 (20 ng/mL varje cytokin) till 10 mL komplett RPMI.
    2. Om lagercytokiner är 10 μg/mL, Pipettera 20 μL av IL-2 och IL-33 till ett 15 mL-rör som innehåller 10 mL komplett RPMI-media.
  3. Förbered lung dissociation medium.
    1. Tillsätt 50 mg av typ 1 kollagenase till 250 mL okompletterad RPMI.
    2. Tillsätt 2,5 mL 100x penicillin-streptomycin-glutamin till 250 mL av mediet i steg 1.3.1.
    3. Blanda försiktigt mediet för att säkerställa att typ 1-Kollagenasen är helt upplöst före användning.
  4. Förbered serum fritt RPMI.
    1. Späd ut 1 g frystorkat bovint serumalbumin (BSA) i 200 mL RPMI.
    2. Tillsätt 2 mL 100x penicillin-streptomycin-glutamin.
    3. Blanda försiktigt mediet för att se till att BSA är helt upplöst i mediet före användning.
  5. Förbered migrations mediet med CCL17.
    1. Skaffa 10 mL serumfritt RPMI och tillsätt CCL17 [50 ng/mL].
      1. Om lager CCL17 är 10 μg/mL, tillsätt 50 μL CCL17 lager till 10 mL serumfritt RPMI-medium.
  6. Förbered migrations mediet med CCL22.
    1. Skaffa 10 mL serumfritt RPMI och tillsätt CCL22 [50 ng/mL].
    2. Om lager CCL22 är 10 μg/mL, tillsätt 50 μL CCL22 lager till 10 mL serumfritt RPMI-medium.
  7. Förbered CCR4 antikropps färgning cocktail.
    1. För 10 tester totalt, tillsätt 5 μL av var och en av följande antikroppar till en 5 mL tub: anti-Mouse CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2 och ICOS.
      Anmärkning: Exempel på hur man gör antikropp cocktail för 10 prover: 0,5 μL av varje antikropp x 10 prover = 5 μL av var och en av de antikroppar som anges i 1.7.1.
    2. För 10 tester totalt, tillsätt 2,5 μL av följande antikroppar mot antikropps cocktail från steg 1.7.1: anti-mus CD3, CD11c, och NK 1,1.
      Anmärkning: Exempel för att komplettera antikropps cocktail för 10 prover: 0,25 μL x 10 prover = 2,5 μL av CD3, CD11c och NK 1.1 antikroppar.
    3. Förvara CCR4-Antikroppstignings cocktail vid 4 ° c tills den är klar att lägga till proverna. Kassera antikropps cocktail efter 1 vecka om den inte används.
  8. Förbered 1x stabiliserande fixativ.
    1. Tillsätt 10 mL avjoniserat destillerat vatten till 5 mL 3x stabiliserande fixerande koncentrat

2. beredning av allergen-ifrågasatta BALB/c möss

Anmärkning: Manliga och kvinnliga BALB/c möss köptes från Charles River (UNMC) eller Jackson Laboratories (University of Utah) vid 6 till 8 veckors ålder.

  1. Efter acklimatisering (1 vecka), sensibilisera alla djur till ägg.
    1. Kombinera 100 μg/mL OVA adsorberat till aluminiumhydroxid (20 mg/mL) i ett 5 mL polystyrenrör.
    2. Blanda röret och dra genast 500 μL av ägg-Alum suspensionen till en 1 mL, 28 G spruta (insulinspruta).
    3. Placera en mus i en klockburk innehållande isofluran (1 – 2 mL under ett falskt golv, så att djuret inte står direkt i isofluran). Låt musen gå under anestesi för cirka 1 – 2 min, eller tills graden av andning droppar.
    4. Snabbt plocka upp musen genom pälsen på ryggen och axlarna och injicera 100 μl av OVA-Alum intraperitonealt per mus21,22.
    5. Placera musen tillbaka i sin bur och titta för att se till att de återfå rörligheten; Detta bör ske inom 2 – 5 minuter.
  2. Sju dagar efter sensibilisering, ämne alla djur till intranasal (i.n.) 1,5% ägg utspädd i steril saltlösning i en nebuliseringskammare (data Sciences International) för 20 min.
    1. Ta bort möss från deras burar och placera dem i den animaliska nebuliseringskammaren. Stäng locket på kammaren.
    2. Fäst nebuliseringsslangen i inmatnings utloppet på nebuliseringskammaren.
    3. Tillsätt 30 mL 1,5% ägg som späds i steril saltlösning till nebulisatorkoppen på nebulisatorn.
    4. Sätt på nebulisatorn och låt kammaren fylla på med dimma i 20 minuter.
    5. Stäng av nebulisatorn och låt dimman sedimentera.
    6. Återlämna djuren till deras burar.
  3. Upprepa steg 2,2 för totalt 5 gånger, på 5 dagar i följd, för att framkalla allergisk inflammation.

3. isolering av CD4+ T-celler från Spleens och LUNGOR av OVA-utmanade möss

  1. Humanely euthanize alla OVA-behandlade manliga och kvinnliga djur genom CO2 kvävning enligt godkända IACUC protokoll, med 2 till 3 djur per grupp, per experiment.
  2. Punkts lungor och mjälte från djur och placera vävnader i separata dissociationsrör baserade på vävnadstyp och kön av djuret23.
  3. Dissociera lungvävnad i 500 μL av lung dissociation media (25 U/mL; kollagenase, typ 1) i den automatiserade vävnads dissociatorn med hjälp av "lung"-protokollet.
    1. Upprepa 3,2 och 3,3 totalt två gånger.
  4. Separera Mjältens vävnad i 500 μL komplett RPMI-media med hjälp av "mjältprotokollet" på den automatiserade vävnads dissociatorn.
    Anmärkning: De återstående stegen ska utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp med steril teknik.
  5. Skölj dissociationsrören som innehåller lung-och mjälthomogena med 5 mL extra lung dissociationsmedia eller komplett RPMI.
  6. Filter cellsuspensioner genom en 40 μm cell sil och samla in 50 mL koniska rör.
  7. Inkubera lung Homogenates i 15 – 30 minuter i en inkubator på 37 ° c med 5% CO2 för att ytterligare separera lungvävnaden.
  8. Tillsätt 5 mL komplett RPMI till lungan och mjälten homogeniserar och pelleten cellerna i botten av 50 mL-rören med centrifugering; 378 x g vid rumstemperatur (RT) i 5 min.
  9. Kombinera splenocyter och lungceller i ett enda 50 mL koniskt rör och Bestäm totala antalet celler med hjälp av automatiserad cell räknare.
  10. Justera manliga och kvinnliga cellsuspensioner till 1 x 108 celler/ml i separations buffert och tillsätt i ett 5 ml polystyren rör.
    Anmärkning: Anriknings protokollet kan justeras upp till 14 mL polystyren rör när fler celler förvärvas från mjälte och lungor. Detta protokoll har utformats för vävnader från 2 – 3 möss per grupp; Därför bör en 5 mL tub räcka.
  11. Använd ungefär två tredjedelar av de totala cellerna för ILC2 isolering enligt ILC2 anriknings protokollet.
    1. Tillsätt antikropps cocktail (50 μL/mL) till cellsuspensionen och inkubera i 5 minuter vid RT.
    2. Vortex snabba sfärer för 30 s och tillsätt i provet med en hastighet av 75 μL/mL cellsuspension. Blanda försiktigt och inkubera i 5 minuter vid RT.
    3. Topp röret upp till 3 mL total volym med separations buffert och placera i 8-kammaren Easy separation magnet. Inkubera i 3 minuter vid RT.
    4. Tips magneten framåt (bort från sfären-antikropp-cell komplex som följs på bak i röret) och Pipettera bort cellsuspensionen i en ren 5 mL tub.
    5. Tillsätt 1,5 mL komplett RPMI till rören och centrifugera vid 378 x g i 5 minuter vid RT.
    6. Häll av media från cellen pellets och Omsuspendera ILC2 på 1 x 107 celler per ml.
    7. Placera 100 uL av manliga och kvinnliga ILC2 per brunn i en U-botten, 96-bra tallrik och tillsätt 100 μL av ILC2 expansions medier till varje brunn.
    8. Inkubera cellerna i 4 – 5 dagar för att expandera ILC2.
    9. Samla in ILC2 i en 5 mL tub och tillsätt upp till 4,5 mL serumfritt RPMI. Centrifugera cellerna vid 378 x g i 5 minuter vid RT.
    10. Räkna celler med en hemacytometer och Omsuspendera vid 1 x 107 ILC2 per ml i SERUMFRITT RPMI.
  12. Använd de återstående cellerna för CD4+ t cell isolering förfarande, som utförs enligt musen CD4+ t cell isolering protokoll med några ändringar.
    1. Tillsätt råtta serum (50 μL/mL) till anrikning av CD4 T-celler.
    2. Tillsätt isolerings cocktail (50 μL/mL) till provet och inkubera i 10 minuter vid RT.
    3. Vortex snabba sfärer för 30 s och tillsätt i provet med en hastighet av 75 μL/mL.
    4. Blanda försiktigt cellsuspensionen och inkubera i 2,5 min och RT
    5. Topp proverna upp till 3 mL och placera 5 mL-rören i 8-kammar Easy separation magnet och inkubera i 5 min vid RT.
    6. Tippa magneten framåt och Pipettera cellsuspensionen i ett rent 5 mL-rör.
    7. Tillsätt 1,5 mL serumfritt RPMI till rören och centrifugera vid 378 x g i 5 minuter vid RT.
    8. Häll av media från cellen pellets och Omsuspendera CD4+ T-celler vid 1 x 107 celler per ml i serum fria RPMI.

4. Bestäm CCR4 uttryck för CD4+ T-celler och grupp 2 innate lymfoida celler (ILC2) från OVA-utmanade djur med flödescytometri

Anmärkning: Följande steg kan utföras på en öppen bänk topp eftersom de är icke-sterila tekniker.

  1. Förvärva cirka 1 – 2,5 x 105 ILC2 celler från steg 3.11.10 och 1 – 2.5 x 106 CD4+ T-celler från steg 3.12.8 i separata 5 ml-rör.
    1. Behåll en extra tub med minst 5,0 x 104 CD4 + T-celler som en obefläckade kontroll.
  2. Suspendera cellerna i 100 – 200 μL FACS-buffert och tillsätt 1 μL av FC-blocket till varje tub och inkubera sedan på is (eller i ett kylskåp på 4 ° c) i 10 minuter.
  3. Tillsätt 1 – 2 mL FACS-buffert till varje tub och centrifugera vid 378 x g i 5 minuter vid RT.
  4. Häll av supernatanten och Omsuspendera cellerna i 100 – 200 μL FACS-buffert.
  5. Tillsätt 37,5 μL av CCR4 antikropps färgning cocktail till cellsuspensionen i varje rör utom röret som innehåller "ofärgade" celler.
  6. Inkubera rören på is, eller i ett kylskåp på 4 ° c, under 20 – 30 minuter.
  7. Tillsätt 1 – 2 mL FACS-buffert till varje tub och centrifugera vid 378 x g i 5 minuter vid RT.
  8. Häll av supernatanten.
  9. Upprepa steg 4,7 och 4,8.
  10. Tillsätt 250 – 300 μL 1x stabiliserande fixativ (se tabell över material) till varje tub.
  11. Förbered enfärgade pärla kontroller för varje antikropp i CCR4 antikropp cocktail enligt det protokoll som medföljer ersättningen pärlor.
    1. Vortex kompensations pärlor.
    2. Tillsätt en droppe av pärlorna till varje enfärgad styrrör.
    3. Tillsätt 1 μL av varje antikropp i CCR4 antikropps cocktail till sin egen märkta tub.
    4. Blanda varsamt och inkubera i 10 minuter i ett kylskåp på 4 ° c eller på is.
    5. Tillsätt 1 – 2 mL FACS-buffert till alla rören och centrifugera vid 378 x g i 5 minuter vid RT.
    6. Häll av supernatanten och Omsuspendera pärlorna i 200 μL av FACS-bufferten.
    7. Kylskåp den enfärgade kontroller tills alla prover är färgade och redo att analyseras på flödescytometern.
  12. Analysera ofärgade celler, enfärgade kontroller och experimentella prover på flödescytometern inom 24 h fixering.

5. förfarande vid flyttning av ex vivo

Anmärkning: Följande steg bör utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp, eftersom de kräver steril teknik.

  1. Förvärva ILC2 från steg 3.11.10 och CD4 T-celler från steg 3.12.8 och bestämma antalet transwell skär som behövs för experimentet.
    Anmärkning: Exempel: för 1,2 mL anrikat CD4 T-celler från steg 3.12.8, multiplicera 1,2 x 1 000 μL = 1 200 μL; dividera sedan 1 200 uL med 100 μL = 12, antalet skär som behövs för CD4 T transmigration.
  2. Flytta försiktigt 3 μm transwell skär från mitten rader av en 24-brunn plattan.
  3. Tillsätt 500 μL migreringsmedia med CCL17 till ungefär en tredjedel av brunnarna.
  4. Tillsätt 500 μL migreringsmedia med CCL22 till en tredjedel av brunnarna.
  5. Tillsätt 500 μL serumfritt RPMI som inte innehåller någon Chemokine till den sista en tredjedel av brunnarna.
  6. Märk locket på plattan tydligt med lämpliga transmigrations medier placerade i botten brunnarna.
  7. Placera transwell infogar tillbaka i brunnar som innehåller de olika behandlingarna.
  8. Tillsätt försiktigt 100 μL av CD4 T-celler eller ILC2 till den övre brunnen för varje skär. Blanda eller Pipettera inte cellsuspensionen upp och ned i transwells, eftersom detta kan vara en gåta för resultatet av experimentet.
  9. Märk tydligt locket på plattan med celltypen placerad i varje brunn och Skriv datum och tid på dagen som cellerna lades till.
  10. Upprepa steg 5,2 till 5,9 tills alla celler har placerats i transwell-skär med media.
  11. Placera försiktigt plattan i en inkubator på 37 ° c med 5% CO2 för 48 h. minimera kontakt med plattan under inkubationstiden.

6. kvantifiering av ex vivo-transmigration

  1. Ta försiktigt bort plattan från inkubatorn och ta bort alla transwell-skären från mittenraderna till de tomma brunnarna strax ovanför eller nedanför.
  2. Samla in cellerna från de nedre och övre brunnar av transwell infogar i rör märkta med topp eller botten, med CCL17, CCL22, eller media, med celltyp, och med replikat nummer (minst 3 replikat per experiment).
  3. Skölj botten brunnarna med 500 μL 1x PBS och samla upp denna sköljning i motsvarande tub.
  4. Skölj de övre brunnarna med 250 μL 1x PBS och samla upp denna sköljning i motsvarande tub.
  5. Pelleten cellerna genom centrifugering vid 378 x g i 5 min vid RT.
  6. Pipettera försiktigt bort alla supernatanten från cellpelleten.
  7. Omsuspendera T-celler och ILC2 i 50 μL 1x PBS.
  8. Ta 10 μL av cellsuspensionen och tillsätt 90 μL 0,4% trypan Blue.
  9. Räkna cellerna på den automatiserade cell räknaren.
    1. Registrera% lönsamhet.
    2. Anteckna antalet celler per mL för varje prov.
    3. Bestäm det totala antalet celler per behandling i toppen och botten kammaren; registrera antal celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CCR4 uttryck på CD4 + T-celler och ILC2.

För att lyckas med ex vivo transmigration experiment, är det absolut nödvändigt att avgöra om lymfocyterna är mottagliga för CCL17 och CCL22 genom CCR4; Därför bestämde vi CCR4 uttryck på både CD4+ T-celler och ILC2 av flödescytometri. Även om det är väl känt att OVA-specifika CD4+ helper T-celler Express CCR4, mindre är känt för uttrycket av CCR4 på ILC2. Figur 1 visar representativa resultat av CCR4 uttryck, jämförelsevis, på CD4+ T-celler (figur 1A, C) och ILC2 (figur 1B, D) från manliga och kvinnliga, OVA-ifrågasatta Balb/C möss. Flödescytometri användes för att detektera CCR4 med hjälp av en monoklonal antikropp som konjugeras till allophycocyanin (APC). Med enkelriktad analys av varians (ANOVA), vi bestämde att det inte fanns några skillnader i CCR4 uttryck mellan manliga och kvinnliga värdar (figur 1A – D), emellertid, uttrycket av CCR4 på en per cell basis (MFI) på ILC2 var högre i jämförelse med CD4 + T-celler (figur 1c jämfört med figur 1d). Dessa resultat är viktiga för att visa att ILC2 och CD4+ T-celler ska svara på CCL17 och CCL22 i följande experiment.

Reaktionsförmåga av CD4+ T-celler till CCR4 ligander i de övre och nedre kamrarna i ett transmigrations system.

CD4+ T-celler från manliga, OVA-utmanade Balb/c-möss isolerades från lungorna och mjälte och placerades i den övre kammaren i en transmigrations apparat åtskild av ett 3 μm poröst membran (figur 2). En sammanfattning av in vivo-beredningen av ägg-behandlade möss (figur 2A) och transmigrations förfarandet (figur 2b) visas som referens. En kombination av CCL17 (25 ng/mL) och CCL22 (25 ng/mL) placerades i den övre kammaren, botten kammaren eller både de övre och undre kamrarna för att bekräfta (figur 2C), (1) att CD4+ T-celler från OVA-utmanade djur var mottagliga för CCR4 ligands, och (2) att Chemokine-inducerad migration var en aktiv process genom vilken T-celler rörde sig genom porerna som svar på Chemokine lutning, och att lymfocyterna inte rörde sig genom porerna oberoende av Chemokine. En media (ingen Chemokine) kontroll ingick för att visa att CD4+ T-celler inte kunde migrera genom 3 μm porer utan stimulering. I detta tillstånd, den högsta andelen celler kvar i den övre kammaren. När chemokines placerades i övre och nedre kammaren samtidigt, vi upptäckte 52% av de totala T-celler i botten kammaren och 48% av cellerna i den övre kammaren (topp/botten behandling). Som förväntat, distributionen av celler flyttas som svar på Chemokine placeras endast i toppen eller endast i botten kammaren, som vi upptäckte den högsta andelen celler i facket där Chemokine var närvarande.

Reaktionsförmågan hos CD4+ T-celler och ILC2 till CCL17 och CCL22 i en transmigrations apparat ex vivo.

CD4 T-celler och ILC2 från manliga och kvinnliga, OVA-utmanade möss isolerades från lungor och mjälte placerades sedan i den övre kammaren i en transwell transmigration apparat (figur 3). Apparatens botten kammare fylldes med obehandlade cell odlingsmedier, mediainnehåll ande CCL17 eller mediainnehåll ande CCL22. De representativa resultaten visar att mindre än 14% (13,37 + 6,5%) av de celler som migrerats i mediekontroll förhållanden (figur 3A – D). Som svar på CCL22, båda celltyper, oavsett om de var från manliga eller kvinnliga värdar, svarade på CCL22 (figur 3A – D), men resultaten för CCL17 var mindre konsekventa. CCL17 inducerade endast signifikant migration för de kvinnliga CD4 T-cellerna och ILC2 jämfört med enbart media (figur 3C, D). CCL17 behandling var inte annorlunda än media för manliga CD4+ T-celler eller manliga ILC2 (figur 3a, B), och CCL22 inducerad större migration än CCL17 i manliga ILC2 (figur 2b).

Suboptimal transmigration resultat för CD4+ T-celler med låg lönsamhet.

Suboptimala resultat genererades för att ge forskaren ett exempel på vad som väntar när transmigration experimentet inte fungerar korrekt (figur 4). Vi isolerade manliga CD4+ T-celler från djur enligt detta protokoll och placerade dem i den övre brunnen av transmigration system. Efter CD4+ T-celler lades, men plattan förblev vid rumstemperatur under de första 24 h, sedan plattan flyttades in i inkubatorn för de återstående 24 h av inkubationstiden. Inte överraskande upptäckte vi ingen migration mot CCL17 och CCL22 (figur 4a) och cellernas livskraft var särskilt låg (< 15%) för cellerna i toppen (figur 4b). Dessa bristfälliga resultat belyser vikten av att använda rätt temperatur och förhållanden som beskrivs i detta protokoll för att uppnå optimala resultat.

Figure 1
Figur 1: CCR4 uttryck på CD4+ T-celler och ILC2. 7 till 9 veckor gamla, manliga och kvinnliga, BALB/c möss injicerades en gång med 100 μl av OVA-adsorberat till aluminiumhydroxid (500 μg/ml; Och 20 mg/mL aluminiumhydroxid) 7 dagar före den första av 5, repetitiva, dagliga luftvägs utmaningar med 1,5% ägg i saltlösning. Allergen-utmanade djur var humant euthanized, och lung-och mjälte vävnad samlades in för ILC2 och CD4+ T celler isolering. En liten alikvot av celler sedan färgas och analyseras av flödescytometri att bestämma nivån på CCR4 på varje celltyp. (A) frekvens av CD4+ T-celler som är CCR4+ från OVA + möss, där felstaplarna representerar standardfelet för medelvärdet (+ SEM). (B) frekvens av ILC2 som var CCR4+ (+ SEM). (C, D) Genomsnittlig fluorescensintensitet (+ SEM) hos CCR4 på (C) CD4 + T-celler och (D) ILC2. Sammanlagt 13 möss användes för att generera dessa data, och flödes experimentet upprepades två gånger, med 3 replikat av varje behandling per experiment. Betydelse bestämdes genom enkelriktad ANOVA. nd anger att det inte fanns några skillnader mellan grupperna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: reaktionsförmåga hos CD4+ T-celler till CCR4 ligander i de övre och undre kamrarna i ett transmigrations system. Manliga Balb/c möss sensibiliserade och utmanas med kyckling ägg äggalbumin (ova) och CD4 + T celler isolerades från mjälte och lungor (A, B). För detta transmigration experiment, CD4+ T-celler avbröts i serum fria medier vid 1 x 107 celler/ml. CCL17 och CCL22 lades till serum fria medier vid en koncentration av 50 ng/mL (25 ng/mL av varje Chemokine för att uppnå totalt 50 ng/mL). Chemokine-innehållande Media lades till den övre kammaren endast, till botten kammaren bara, eller till både övre och nedre kammare. En total volym på 500 μL av transmigrations medier lades till de nedre brunnarna och 100 μL cellulär suspension (1 x 106 celler/brunn) lades till den övre brunnen. Transmigration mättes efter 48 h i kultur (C). Dessa data genererades från ett enda experiment, 3 OVA-behandlade, manliga möss användes för vävnad insamling, och 3 replikat gjordes per behandling. Statistisk signifikans fastställdes genom enkelriktad ANOVA. *p < 0,05. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: reaktionsförmåga hos CD4 + T-celler och ILC2 till CCL17 och CCL22 i en transmigrations apparat från ex vivo . Möss bereddes som i figur 1 för CD4+ T-cell och ILC2 isolering från mjälte och lungor. CD4+ T-celler och ILC2 avbröts i serum fria medier vid 1 x 107 celler/ml. CCL17 eller CCL22 har tillsatts till serum fria medier med en koncentration på 50 ng/mL. 500 μL av transmigrations medier lades till de nedre brunnarna och 100 μL cellulär suspension (1 x 106 celler/brunn) lades till den övre brunnen. Transmigration mättes efter 48 h i kultur. (A) CD4+ T-celler och (B) ILC2 från manliga värdar BEHANDLADES med media som kontroll, CCL17, eller CCL22. Likaså (C) kvinnliga CD4+ T-celler och (D) kvinnliga ILC2 behandlades med media, CCL17, eller CCL22. Totalt 14 möss användes för att generera dessa data. Transmigration experimentet upprepades 4 gånger, med 3 – 6 replikat av varje behandling per experiment. Betydelse bestämdes genom enkelriktad ANOVA. *p < 0,05, * * *p < 0,001, * * * *p < 0,0001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: suboptimal transmigration resultat för CD4 T-celler med låg lönsamhet. Naiva manliga BALB/c-möss förvärvades för insamling av lung-och mjältvävnad och CD4+ T-cellsisolering som i figur 1, figur 2och figur 3. CD4 T-celler lades till den övre kammaren av transmigration apparaten och serum fria medier som innehåller CCL17, CCL22 eller ingen Chemokine (Media Control) lades till botten brunnen. För de första 24 h av experimentet plattan lämnades vid rumstemperatur, då det flyttades till en 37 ° c inkubator med 5% CO2 för ytterligare 24 h. (a) procentandel celler kvar i övre och nedre brunnar efter 24 h.B) genomförbarheten av C D4 + T-celler i topp-och botten kammaren efter dåliga inkubationsförhållanden. Dessa data genererades från ett enda experiment, 3 naiva hanmöss användes för vävnads uppsamling, och 3 replikat gjordes per behandling. Statistisk signifikans fastställdes inte. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Häri presenterar vi en väl etablerad metod för att bedöma Chemokine-inducerad migration av lymfocyter i ett ex vivo transmigration system. Det finns flera kritiska steg i protokollet, varav den första är att kontrollera uttrycket av rätt Chemokine receptor på immuncellerna i experimentet. I våra händer valde vi CCR4 på grund av kroppen av litteratur som belyser vikten av CCR4 på Th2 helper T-celler i allergisk inflammation. Ovalbumin-inducerad inflammation visades tidigare att begränsas av minst två CCR4-antagonister24,25; Detta var dock före upptäckten av gruppen 2 medfödda lymfoida celler (ILC2)26,27. Vi genererade nya data som visar att ILC2 celler uttrycker högre CCR4 än CD4+ T-celler och visade att dessa celler var konsekvent lyhörd för CCL22.

Ett andra kritiskt steg att följa i protokollet är att se till att cellerna hålls i optimalt medium för kulturen innan de påbörjar transmigration delen av protokollet. När det gäller ILC2 var vi tvungna att odla dessa celler i ILC2 expansions medier som innehåller både IL-2 och IL-33. Il-2 och Il-7 rapporteras båda i litteraturen för att stödja ILC2 i kulturen i upp till 14 dagar28,29. Om lönsamhet blir ett problem för CD4+ T-celler och ILC2 i framtida experiment, skulle tillägg av Il-2 eller Il-7 sannolikt förbättra överlevnaden av lymfocyter tills slutpunkten av experimentet. Var och en av de medier som presenteras häri definierades under loppet av flera experiment och optimerades för användning i detta protokoll14,30,31. I figur 4presenterade vi felaktiga resultat för att demonstrera vikten av att använda en inkubator med rätt temperatur och 5% Co2. Att hålla transmigrations plattorna i inkubatorn där de inte störs är ett annat kritiskt steg för protokollets framgång.

Som tidigare nämnts, det finns fördelar med att använda in vivo mikroskopi finns på de flesta institutioner, men in vivo avbildning kan vara tidskrävande och kostsamt. Ett alternativt experiment förfarande som är mindre kostsamt använder mikrofluidik i kombination med Chemokine gradienter för att förstå leukocyt extravasering och vävnads migration32,33,34. Dessa system håller vetenskapligt värde eftersom de bedömer komplexiteten i cellkinetik som involverar endotelceller, som kan odlas på kapillärerna i mikroflödessystem system. Dessutom, dessa mikroflödessystem system bedöma vikten av anhängare proteiner (t. ex., e-cadherin) på endotelceller och integriner på immuncellerna i processen för cell följsamhet under blodflödet. Icke desto mindre kräver dessa system specialiserad utrustning och komplicerad beräknings programmering och statistik för att fastställa vikten av varje behandlings villkor. Även om begränsningen av den transmigrations metod som presenteras här är att den är konstgjord, kan den därför användas som ett viktigt screening verktyg för att begränsa avfallet av onödiga reagenser i efterföljande in vivo-metoder. Betydelsen av metoden är att när nya celler upptäcks, vilket är fallet för ILC2, kan vi avskärma dessa celler för deras lyhördhet för kända chemokines. Detta är en av de framtida tillämpningar som involverar ILC2 och potentiella terapier som kan hämma deras migration till lungorna under astmaexacerbation. Detta transmigration protokoll kommer att användas för att avskärma olika hämmare som kan användas för att begränsa CCR4 eller andra kemotaktisk medlare inblandade i rekrytering ILC2. Sammantaget kommer detta protokoll från ex vivo-transmigration att leda till generering av kritiska data som kan verifieras med framtida in vivo-experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga finansiella upplysningar eller intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av American lung Association (K.J.W.), minnesmärket Eugene Kenney Fund tilldelas T.A.W. och K.J.W., generösa start-up stöd från University of Utah för K.J.W., och en avdelning för Veterans Affairs Award till T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. är mottagare av en forskarkarriär Scientist Award (IK6 BX003781) från Department of Veterans Affairs. Författarna vill erkänna redaktionellt stöd från MS Lisa Chudomelka. Författarna tackar UNMC Flow flödescytometrianalys Core för deras stöd för att samla in flödet flödescytometrianalys data som genereras för detta manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich 15250061
1 mL syringe BD Bioscience 329424 U-100 Syringes Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine Gibco 10378-016 Dilute to 1x in RPMI media
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101 polypropylene tubes
3 μm transwell inserts Genesee Scientific 25-288 24-well plate containing 12 transwell inserts
3x stabilizing fixative BD Pharmigen 338036 Prepare 1x solution according to manufacturers protocol
5 mL polystyrene tubes STEM Cell Technologies 38007
50 mL conical tubes Olympus Plastics 28-106 polypropylene tubes
8-chamber easy separation magnet STEM Cell Technologies 18103
ACK Lysing Buffer Life Technologies Corporation A1049201
Advanced cell strainer, 40 μm Genesee Scientific 25-375 nylon mesh, 40 μm strainers
Aluminum Hydroxide, Reagent Grade Sigma-Aldrich 239186-25G 20 mg/mL
anti-mouse CCR4; APC-conjugated Biolegend 131211 0.5 μg/test
anti-mouse CD11b BD Pharmigen 557396 0.5 μg/test
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 Thermo-Fischer Scientific 61-0114-82 0.25 μg/test
anti-mouse CD16/32, Fc block BD Pharmigen 553141 0.5 μg/test
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated Thermo-Fischer Scientific 47-0193-82 0.5 μg/test
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated BD Pharmigen 552774 0.25 μg/test
anti-mouse CD45; PE conjugated BD Pharmigen 56087 0.5 μg/test
anti-mouse ICOS (CD278) BD Pharmigen 564070 0.5 μg/test
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated BD Pharmigen 553164 0.25 μg/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated Biolegend 145311 0.5 μg/test
Automated Cell Counter BIORAD 1450102
Automated Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich A2153-10G 0.5% in serum-free RPMI
Cell Counter Clides BIORAD 1450015
Chicken Egg Ovalbumin, Grade V Sigma-Aldrich A5503-10G 500 μg/mL
Collagenase, Type 1, Filtered Worthington Biochemical Corporation CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) 25 U/mL in RPMI
Compensation beads Affymetrix 01-1111-41 1 drop per contol tube
Dissociation Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-335
FACS Buffer BD Pharmigen 554657 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C
Heat Inactivated-FBS Genesee Scientific 25-525H 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
Mouse CCL17 GenScript Z02954-20 50 ng/mL
Mouse CCL22 GenScript Z02856-20 50 ng/mL
Mouse CD4+ T cell enrichment kit STEM Cell Technologies 19852
Mouse IL-2 GenScript Z02764-20 20 ng/mL
Mouse ILC2 enrichment kit STEM Cell Technologies 19842
Mouse recombinant IL-33 STEM Cell Technologies 78044 20 ng/mL
RPMI Life Technologies Corporation 22400071
Separation Buffer STEM Cell Technologies 20144 1x PBS + 2% FBS; stored at 4 °C
Small animal nebulizer and chamber Data Sciences International
Sterile saline Baxter 2F7124; NDC 0338-0048-04 0.9% Sodium Chloride

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Tags

Immunologi och infektion nr 151 CCL17 (C-C motiv Chemokine 17)/Tarc (Thymus och aktivering relaterade Chemokine) CCL22 (C-C motiv Chemokine 22)/MDC (Makrofage-derived Chemokine) CCR4 (CC Chemokine receptor 4) CD4 T-cell (CD4 + T Helper cell)/Th2 cell ILC2: (grupp 2 innate lymfoid cell) ägg (kyckling ägg ovalbumin)
Bedömning av Lymfocytmigration i ett transmigrations system ex vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, K. J., Wyatt, T. A.… More

Warren, K. J., Wyatt, T. A. Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System. J. Vis. Exp. (151), e60060, doi:10.3791/60060 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter