Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Published: September 20, 2019 doi: 10.3791/60060
Automatic Translation
1,3, 2,3,4
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

Summary

Bu protokolde lenfositler, alt odadan gözenekli bir zarla ayrılan bir transmigration sisteminin üst odasına yerleştirilir. Keokin alt hazneye eklenir, bu da bir kemokin gradyan boyunca aktif göçe neden olur. 48 saat sonra, lenfositler transmigration quantitate için her iki odada sayılır.

Abstract

Burada, ex vivo transmigration sisteminde lenfosit kemokinetik hareketini değerlendirmek için temel laboratuvar becerileri ve malzemeleri ile yürütülebilecek etkili bir yöntem salıyoruz. Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2) ve CD4+ T yardımcı hücreleri tavuk yumurtası ovalbumin (OVA)-meydan BALB/ c farelerin dalak ve akciğerlerinden izole edildi. Hem CD4+ T hücrelerinde hem de ILC2'de CCR4 ekspresyonunu nispeten doğruladık. CCL17 ve CCL22 CCR4 için bilinen ligands vardır; bu nedenle, bu ex vivo transmigration yöntemini kullanarak CCL17- ve CCR4+ lenfositlerin CCL22 kaynaklı hareketi inceledik. Kemoin gradyanları oluşturmak için, CCL17 ve CCL22 transmigration sisteminin alt odasına yerleştirildi. İzole lenfositler daha sonra üst odalara eklendi ve 48 saat lik bir süre içinde lenfositler aktif olarak 3 μm gözeneklerden alt odadaki kemokine doğru göç ettiler. Bu lenfositlerin kemokinetikbelirlemek için etkili bir sistemdir, ama, anlaşılır, in vivo organ mikroortamlarında bulunan karmaşıklığı taklit etmez. Bu çalışma altında organ ve lenfositlerin yerinde görüntüleme eklenmesi ile aşılabilir yöntemin bir sınırlamadır. Buna karşılık, bu yöntemin avantajı, canlı görüntüleme çok daha uygun maliyetli bir oranda bir giriş seviyesi teknisyen tarafından yapılabilir olmasıdır. Terapötik bileşikler göçü artırmak için kullanılabilir hale geldikçe, tümör sitotoksik bağışıklık hücrelerine sızma durumunda olduğu gibi, ya da göçü inhibe etmek için, belki de immünolojinin endişe verici olduğu otoimmün hastalıklarda, bu yöntem tarama aracı. Genel olarak, ilgi chemokine sürekli medya kontrolü daha istatistiksel olarak daha yüksek bir düzeyde kemokinetik üreten ise yöntem etkilidir. Bu gibi durumlarda, belirli bir bileşik tarafından inhibisyon / geliştirme derecesi de belirlenebilir.

Introduction

Bu orijinal transmigration yöntemi Stephen Boyden tarafından 1962 yılında Journal of Experimental Medicine1'desunulmuştur. Kemotaksis ve keokinetik hakkında bildiklerimiz Boyden odasının gelişimi olmadan mümkün olmazdı. 1977 yılında ilk kemokin keşfinden önce, ex vivo transmigration sistemleri nötrofiller hücresel hareketlilik yükseltirken makrofajlarda hücresel hareketi durdurabilecek serum faktörleri hakkında bilgi edinmek için kullanılmıştır1,2. Bağışıklık hücresi göçü ile ilgili olarak büyük bir bilgi zenginliği geliştirilmiştir, ve bugüne kadar, 47 kemokinler şimdi 19 ilgili reseptörleri3ile keşfedilmiştir,4. Buna ek olarak, inhibitörleri / bu kemokin yollarının arttırıcılar çoksayıda terapötik amaçlar için geliştirme uğramıştır5,6,7,8. Bu bileşiklerin çoğu belirli bir kemokin 9 bileşikler ve bağışıklık hücresi yanıt arasındaki doğrudan etkileşimleri anlamak için benzer transmigration odalarında test edilmiştir.

Transmigration, veya diapedesis, iltihaplı doku içine açık enfeksiyon için sağlıklı bir inflamatuar yanıt için önemli bir süreçtir10,11. Bir Boyden odası, transmigration sistemi, veya transwell cihazları genellikle gözenekli bir membran1,12ile ayrılmış iki odacık oluşur. Alt oda en sık ilgi chemokine içeren medya tutar, lökositler üst odaya yerleştirilir iken. Membrandaki gözeneğin boyutu, ilgi çeken hücrenin büyüklüğüne göre seçilebilir. Bu proje için, lenfoid hücreler hücresel gelişim aşamasına bağlı olarak 7-20 μm boyutunda olduğundan, 3 μm gözenekli membran seçtik. Bu gözenek boyutu, bu hücrelerin gözeneklerin içinden pasif olarak düşmemesini, ancak kemokin degradesine yanıt olarak aktif olarak göç etmesini sağlar.

Bu protokolün en büyük avantajı maliyet etkinliğidir. In vivo transmigration zordur, çünkü hayvan taşıma ve cerrahi konusunda kapsamlı bir eğitim gerektirir ve genellikle bir araştırmacının her zaman kullanamadığı yüksek güçlü mikroskopi içerir. Transmigration'i artırıcı veya inhibe ettiği düşünülen bileşiklerin uygun maliyetli taranması in vivo görüntüleme öncesinde gerçekleştirilebilir. Transmigration sistemi sıkı bir şekilde kontrol edilince, hücreler başlangıçta transwell cihazına eklenebilir, ya da tam tersi, kemokin önce keokin inhibitörü ile tedavi edilebilir, sonra hücreler transwell cihazına eklenebilir. Son olarak, bu bariyer hücrelerinin kemokinetiklere katılımını anlamak için transwell insertinin altına transwell insert1-2 gün önce eklenebilir. Yine, sistemin bu manipülasyonlar vivo çalışmalarda daha karmaşık öncesinde belirli bir bileşiğin etkinliği hakkında önemli bilgileri belirleme güçlü bir araç sağlar.

Bir transmigration oda sistemi kullanarak çeşitli in vivo ve in vitro koşullar altında lenfosit hareketliliği değerlendirmek için etkili bir yoldur12,13,14. Burada, bir transmigration odasında kemokinlere ex vivo lenfosit duyarlılığını değerlendirmek için optimize edilmiş bir yöntem tanımlıyoruz. Bu örnek deneyde, CD4+ T hücreleri ve grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2) OVA-alerjen maruziyetini takiben erkek ve dişi BALB/c farelerinden izole edildi. Alerjene meydan okuyan farelerden CCR4 + CD45+ Lineage- (LIN-) ILC2'nin CCR4+ CD4+ T yardımcı hücrelerden ccl17 ve CCL22'ye daha verimli bir şekilde göç edeceği hipotezi oluşturuldu. CCL17 ve CCL22 genellikle dendritik hücreler ve M2 makrofajlar tarafından üretilen kemokinler (alerjik) fenotip, diğer hücreler arasında, alerji15,16. CCL17 ve CCL22 onlar kolayca hava yolu alevlenmeleri sırasında akciğerlerde tespit edilir gibi alerjik inflamasyon biyobelirteçleri olarak düşünülebilir16,17,18. Daha da önemlisi, CCR4 ekspresyonu, ev tozu işledi hayvanlardan izole edilen ILC2'den elde edilen biyoinformatik verilerde ortaya konan ve benzer şekilde IL-33 ile ex vivo ile tedavi edilen saf hayvanlardan ILC2'nin işlenmemiş kontrollere göre yükseltilir ( alerjen teşvik doğuştan sitokin) CCR419,20düzenler. Ayrıca, Immünolojik Genom Projesi veritabanında (www.immgen.org) ILC2 verilerine göre, CCR4 mRNA bu doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinde yüksek oranda ifade edilir. Bugüne kadar ILC2'nin dokulara ticareti konusunda çok az şey bilinmektedir, ancak ILC2 ve CD4+ T hücrelerinin benzer transkripsiyon faktörleri ve reseptörleri ifade ettikleri için kemotaksiler ve kemokinetikler için benzer kemokinler ve reseptörler kullanmaları muhtemeldir. Böylece, CCL17 karşı CCL22 duyarlılık karşılaştırıldı, ILC2 ve CD4+ T lenfositler, hem erkek hem de kadın, OVA meydan hayvanlardan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada açıklanan tüm yöntemler Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi (UNMC) ve Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.

1. Reaktiflerin Kurulumu ve Hazırlanması

  1. Komple RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medya hazırlayın.
    1. 90 mL RPMI'ye 10 mL ısı yalıtılmış fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
    2. 100x Penisilin-Streptomisin-Glutamin 100 mL% 10 FBS RPMI 1mL ekleyin.
  2. ILC2 genişletme ortamını hazırlayın.
    1. 10 mL'lik tam RPMI'ye IL-2 ve IL-33 (her sitokine 20 ng/mL) ekleyin.
    2. Stok sitokinleri 10 μg/mL ise, pipet 20 μL IL-2 ve IL-33 10 mL tam RPMI ortam içeren 15 mL'lik bir tüpiçine.
  3. Akciğer Dissociation Medium hazırlayın.
    1. 250 mL eklanmamış RPMI tip 1 kollajenaz 50 mg ekleyin.
    2. Adım 1.3.1'deki 250 mL ortama 2,5 mL 100x penisilin-streptomisin-glutamin ekleyin.
    3. Tip 1 Kollajenaz'ın kullanılmadan önce tamamen çözünmesini sağlamak için ortamı hafifçe karıştırın.
  4. Serumsuz RPMI hazırlayın.
    1. RPMI 200 mL lyophilized sığır serum albumin (BSA) seyreltilmesi 1 g.
    2. 100x penisilin-streptomisin-glutamin 2 mL ekleyin.
    3. BSA'nın kullanılmadan önce medyada tamamen çözünmesini sağlamak için ortamı yavaşça karıştırın.
  5. CCL17 ile Geçiş Ortamı nı Hazırlayın.
    1. 10 mL serumsuz RPMI edinin ve CCL17 [50 ng/mL] ekleyin.
      1. Stok CCL17 10 μg/mL ise, 10 mL serumsuz RPMI ortama 50 μL CCL17 stok ekleyin.
  6. CCL22 ile Geçiş Ortamını Hazırlayın.
    1. 10 mL serumsuz RPMI edinin ve CCL22 [50 ng/mL] ekleyin.
    2. Stok CCL22 10 μg/mL ise, 10 mL serumsuz RPMI ortama 50 μL CCL22 stok ekleyin.
  7. CCR4 Antikor Boyama Kokteyli hazırlayın.
    1. Toplam 10 test için, aşağıdaki antikorların her birini 5 mL'lik bir tüpe ekleyin: anti-mouse CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2 ve ICOS.
      NOT: 10 örnek için antikor kokteyli nasıl yapılır örneği: Her antikor x 10 numunenin 0,5 μL'si = 1,7.1'de listelenen antikorların her birinin 5 μL'si.
    2. Toplam 10 test için, 1.7.1 adımdan antikor kokteyline aşağıdaki antikorlardan 2.5 μL ekleyin: anti-mouse CD3, CD11c ve NK1.1.
      NOT: Örnek 10 örnek için antikor kokteyli tamamlamak için: 0.25 μL x 10 örnekleri = 2.5 l CD3, CD11c ve NK1.1 antikorları.
    3. CCR4 Antikor Boyama Kokteylini numunelere eklemeye hazır olana kadar 4 °C'de saklayın. Kullanılmadığı takdirde 1 hafta sonra antikor kokteylini atın.
  8. 1x Stabilizatör fikstür hazırlayın.
    1. 5 mL 3x stabilizatör konsantresine 10 mL deiyonize su ekleyin

2. Alerjene meydan okuyan BALB/c Farelerin hazırlanması

NOT: Erkek ve dişi BALB/c fareleri Charles River (UNMC) veya Jackson Laboratories'den (Utah Üniversitesi) 6-8 haftalık kensatın alındı.

  1. Alışma (1 hafta) sonra, OVA tüm hayvanları duyarlı.
    1. 5 mL polistiren tüpte alüminyum hidroksite (20 mg/mL) 100 μg/mL OVA adsorded'i birleştirin.
    2. Tüpü karıştırın ve hemen 500 μL OVA-şap süspansiyonuna 1 mL, 28 G şırınga (insülin şırıngası) içine çekin.
    3. Fareyi izofluran içeren bir çan kavanozuna yerleştirin (1-2 mL yanlış bir zeminin altına, böylece hayvan doğrudan isoflurane'de durmuyor). Farenin yaklaşık 1-2 dakika veya solunum hızı düşene kadar anestezi altında gitmesine izin verin.
    4. Hızlı bir şekilde arka ve omuzlarda kürk tarafından fare almak ve fare21,22başına OVA-şap intraperitoneally 100 μL enjekte .
    5. Fareyi kafesine geri yerleştirin ve hareket kabiliyetini yeniden kazanmak için izleyin; bu 2-5 dakika içinde meydana gelmelidir.
  2. Sensitizasyondan yedi gün sonra, tüm hayvanları 20 dakika boyunca bir nebülizasyon odasında (Data Sciences International) steril salinle seyreltilmiş intranazal (i.n.) %1.5 OVA'ya tabi takın.
    1. Fareleri kafeslerinden çıkarın ve hayvan bulutsusu odasına yerleştirin. Odanın kapağını kapatın.
    2. Nebülizasyon hortumunu nebülizasyon odasındaki giriş emzilesine takın.
    3. Nebülizör üzerindeki nebülizasyon kabına steril salinle seyreltilmiş %1,5 OVA'nın 30 mL'sini ekleyin.
    4. Nebülizörü açın ve odanın 20 dakika boyunca sisle dolmasını bekleyin.
    5. Nebülizörü kapatın ve sisin durulmasına izin verin.
    6. Hayvanları kafeslerine geri getirin.
  3. Alerjik inflamasyona neden olmak için 5 gün üst üste 5 kez toplam adım 2.2 tekrarlayın.

3. CD4+ T Hücrelerinin Dalaklardan ve Akciğerlerden OVA'ya Meydan Okuyan Farelerden İzolasyon

  1. İnsanca co2 boğulma tarafından tüm OVA tedavi erkek ve dişi hayvanlar tarafından onaylanmış IACUC protokollerine göre, grup başına 2-3 hayvan kullanarak, deney başına.
  2. Besinler in akciğerleri ve hayvanlardan dalak ve hayvanın doku tipi ve cinsiyetine göre ayrı ayrışma tüpleri dokuları yerleştirin23.
  3. 'Akciğer' protokolünü kullanarak otomatik doku dissosiyatöründe 500 μL'lik akciğer dokusunu (25 U/mL; kollajenaz, tip 1) ayrıştırın.
    1. 3.2 ve 3.3'ü toplam iki kez tekrarlayın.
  4. Otomatik doku dissosiyatöründeki 'dalak' protokolünü kullanarak 500 μL'lik komple RPMI media'da dalak dokusunu ayrıştırın.
    NOT: Geri kalan adımlar steril teknik kullanılarak Biyolojik Güvenlik kabininde yapılmalıdır.
  5. Akciğer ve dalak homojeni içeren ayrışma tüplerini sırasıyla 5 mL ek Akciğer Ayrıştırma media veya Komple RPMI ile durulayın.
  6. Filtre hücresi süspansiyonları 40 μm hücresüzden geçirin ve 50 mL konik tüpler halinde toplayın.
  7. İnkübasyon akciğer ilerlü15-30 dakika boyunca 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde %5 CO2 ile daha fazla ayrıştırılar.
  8. Akciğere 5 mL Komple RPMI ekleyin ve santrifüj kullanarak 50 mL tüplerin altındaki hücreleri dalak homojen ve pelet; Oda sıcaklığında 378 x g (RT) 5 dk.
  9. Tek bir 50 mL konik tüp içine splenositler ve akciğer hücreleri birleştirin ve otomatik hücre sayacı kullanarak toplam hücre sayılarını belirlemek.
  10. Ayırma tamponunda erkek ve kadın hücre süspansiyonlarını 1 x 108 hücre/mL'ye ayarlayın ve 5 mL polistiren tüpe ekleyin.
    NOT: Zenginleştirme Protokolü, dalak ve akciğerlerden daha fazla hücre elde edildiğinde 14 mL polistiren tüplere kadar ayarlanabilir. Bu protokol grup başına 2-3 fareden dokular için tasarlanmıştır; bu nedenle 5 mL'lik bir tüp yeterli olacaktır.
  11. ILC2 zenginleştirme protokolüne göre ILC2 yalıtımı için toplam hücrelerin yaklaşık üçte ikisini kullanın.
    1. Hücre süspansiyonuna antikor kokteyli (50 μL/mL) ekleyin ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    2. 30 s için girdap hızlı küreler ve hücre süspansiyon 75 l /mL oranında numuneye ekleyin. Yavaşça karıştırın ve RT 5 dakika kuluçka.
    3. Bölme tamponu ile 3 mL toplam hacmine kadar tüp top ve 8 odalı kolay ayırma mıknatıs yer. RT'de 3 dakika kuluçka.
    4. Mıknatısı ileri ye doğru (tüpün arkasına yapışmış küre-antikor hücre komplekslerinden uzağa) ve hücre süspansiyonundan temiz bir 5 mL tüpe pipet le kaplayın.
    5. Tüplere 1,5 mL tam RPMI ekleyin ve 378 x g'de 5 dakika RT'de santrifüj ekleyin.
    6. Hücre peletinden ortamı dökün ve ILC2'yi mL başına 1 x 107 hücrede yeniden askıya alın.
    7. U-alt, 96-iyi plaka iyi başına erkek ve kadın ILC2 100 uL yerleştirin ve her kuyuya ILC2 Genişleme Medya 100 μL ekleyin.
    8. ILC2 genişletmek için 4-5 gün boyunca hücreleri kuluçka.
    9. ILC2'yi 5 mL'lik bir tüpe toplayın ve 4,5 mL'ye kadar serumsuz RPMI ekleyin. Hücreleri 378 x g'de 5 dk RT'de santrifüj edin.
    10. Serumsuz RPMI'de hemacytometre kullanarak hücreleri sayın ve mL başına 1 x 107 ILC2'de yeniden askıya alın.
  12. FareCD4 + T hücre izolasyon protokolüne göre birkaç değişiklik le yapılan CD4+ T hücre yalıtımı yordamı için kalan hücreleri kullanın.
    1. CD4 T hücre zenginleştirme süspansiyonuna fare serumu (50 μL/mL) ekleyin.
    2. Numuneye Izolasyon kokteyli (50 μL/mL) ekleyin ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Girdap hızlı küreler 30 s ve 75 μL/mL oranında numuneye ekleyin.
    4. Hücre süspansiyonuna yavaşça karıştırın ve 2,5 dakika ve RT için kuluçkaya yatırın
    5. Numuneleri 3 mL'ye kadar toplayın ve 5 mL'lik tüpleri 8 odalı kolay ayırma mıknatısına yerleştirin ve 5 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
    6. Mıknatısı ileri ve pipetle hücre süspansiyonuna temiz bir 5 mL boruya getirin.
    7. Tüplere 1,5 mL serumsuz RPMI ekleyin ve 378 x g'de 5 dakika RT'de santrifüj ekleyin.
    8. Hücre peletinden ortam dökün ve serumsuz RPMI'de CD4+ T hücrelerini mL başına 1 x 107 hücrede yeniden askıya alın.

4. FLOW Sitometri ile OVA'ya meydan okuyan Hayvanlardan CD4+ T Hücrelerinde CCR4 Ekspresyonu ve Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücreleri (ILC2) belirleyin

NOT: Steril olmayan teknikler olduğu için aşağıdaki adımlar açık bir bankın üst kısmında gerçekleştirilebilir.

  1. 3.11.10 ve 1-2.5 x 106 CD4+ T hücrelerinden 3.12.8 adımından ayrı 5 mL tüplerde yaklaşık 1-2,5 x 105 ILC2 hücreleri elde edin.
    1. Lekesiz bir kontrol olarak en az 5,0 x 104 CD4+ T hücreden oluşan ek bir tüp tutun.
  2. Hücreleri 100-200 μL FACS tamponunda askıya alın ve her tüpe 1 μL Fc Block ekleyin, ardından 10 dakika boyunca buzüzerinde (veya 4 °C'lik bir buzdolabında) kuluçkaya yatırın.
  3. RT'de 5 dakika boyunca 378 x g'de her tüpe 1-2 mL FACS Tampon ve santrifüj ekleyin.
  4. Supernatant dökün ve FACS Tampon 100-200 μL hücreleri yeniden askıya.
  5. 'Lekesiz' hücreleri içeren tüp hariç her tüpteki hücre süspansiyonuna 37,5 l CCR4 Antikor Boyama Kokteyli ekleyin.
  6. Tüpleri 20-30 dakika boyunca buz üzerinde veya 4 °C'lik bir buzdolabında kuluçkaya yatırın.
  7. RT'de 5 dakika boyunca 378 x g'de her tüpe 1-2 mL FACS Tampon ve santrifüj ekleyin.
  8. Supernatant dökün.
  9. 4.7 ve 4.8 adımlarını tekrarlayın.
  10. Her tüpe 250-300 μL 1x sabitleme fiksatifi ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu).
  11. CcR4 antikor kokteylindeki her antikor için tek renkli boncuk kontrolleri, tazminat boncukları ile sağlanan protokole göre hazırlayın.
    1. Vortex tazminat boncuklar.
    2. Her tek renkli kontrol tüpüne boncuk bir damla ekleyin.
    3. CCR4 Antikor kokteylindeki her antikordan 1 μL'lik bir taneyi kendi etiketli tüpüne ekleyin.
    4. 4 °C'lik bir buzdolabında veya buz üzerinde 10 dakika boyunca hafifçe karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
    5. Tüm tüplere 1-2 mL FACS Tampon ekleyin ve 378 x g'de 5 dk RT'de santrifüj.
    6. Supernatant dökün ve FACS tampon 200 μL boncuklar resuspend.
    7. Tüm numuneler lekeli ve akış sitometre üzerinde analiz edilinceye kadar tek renkli kontrolleri soğutun.
  12. Lekelenmemiş hücreleri, tek renkli kontrolleri ve akış sitometresindeki deneysel örnekleri fiksasyondan 24 saat sonra analiz edin.

5. Ex Vivo Transmigration Prosedürü

NOT: Aşağıdaki adımlar steril teknik gerektirdiğinden Biyolojik Güvenlik Kabini'nde yapılmalıdır.

  1. ILC2'yi adım 3.11.10'dan ve CD4 T hücrelerini 3.12.8 adımından edinin ve deney için gereken transwell uçlarının sayısını belirleyin.
    NOT: Örnek: 3.12.8 adımdan zenginleştirilmiş CD4 T hücrelerinin 1,2 mL'si için 1,2 x 1.000 μL = 1.200 μL çarpın; sonra 1.200 uL'yi 100 μL = 12'ye bölün, CD4 T geçişi için gereken kesici uç sayısı.
  2. 24 kuyulu bir plakanın orta sıralarından 3 μm transwell kesici uçları yavaşça hareket ettirin.
  3. CCL17 ile 500 μL'lik geçiş ortamını kuyuların yaklaşık üçte birine ekleyin.
  4. Kuyuların üçte birine CCL22 ile 500 μL'lik geçiş ortamı ekleyin.
  5. Kuyuların son üçte birine kemokin içermeyen 500 μL serumsuz RPMI ekleyin.
  6. Plakanın kapağını alt kuyulara yerleştirilen uygun transmigration ortamıyla net bir şekilde etiketle.
  7. Transwell ekler geri çeşitli tedaviler içeren kuyulara yerleştirin.
  8. Her kesici uçtaki en üst kuyuya 100 μL CD4 T hücresi veya ILC2 ekleyin. Hücre süspansiyonuna transwelllerde yukarı ve aşağı karıştırmayın veya pipetlemayın, çünkü bu deney sonuçlarını karıştırabilir.
  9. Plakanın kapağını her kuyuya yerleştirilen hücre tipiyle net bir şekilde etiketlendirin ve hücrelerin eklendiğinin tarih ve saatini yazın.
  10. Tüm hücreler ortamla transwell kesici uçlara yerleştirilene kadar 5,2 ile 5,9 adımlarını tekrarlayın.
  11. Plakayı % 5 CO 2 ile %5 CO2 ile 37 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin.

6. Ex Vivo Transmigration'ın Nicelleştirilmesi

  1. Plakayı kuvözden yavaşça çıkarın ve orta sıralardan tüm transwell kesici uçlarını hemen üstündeki veya altındaki boş kuyulara çıkarın.
  2. Hücreleri, transwell eklerin alt ve üst kuyularından ÜST veya ALT ile etiketlenmiş tüplere, CCL17, CCL22 veya ortamla, hücre türüyle ve çoğaltma numarasıyla (deney başına en az 3 çoğaltma) toplayın.
  3. Alt kuyuları 500 μL 1x PBS ile durulayın ve bu durulamayı ilgili tüpe toplayın.
  4. Üst kuyuları 250 μL 1x PBS ile durulayın ve bu durulamayı ilgili tüpe toplayın.
  5. Rt 5 dk için 378 x g santrifüj ile hücreleri pelet.
  6. Yavaşça hücre pelet tüm supernatant kapalı pipet.
  7. T hücrelerini ve ILC2'yi 1x PBS'nin 50 μL'ine yeniden askıya alın.
  8. Hücre süspansiyonlarının 10 μL'sini alın ve %0,4 trypan mavisi 90 μL'ye ekleyin.
  9. Otomatik hücre sayacındaki hücreleri say.
    1. %canlılığı kaydedin.
    2. Her örnek için mL başına hücre sayısını kaydedin.
    3. Üst ve alt odadaki tedavi başına toplam hücre sayısını belirleyin; hücre sayılarını kaydedin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CD4+ T hücrelerinde CCR4 ekspresyonu ve ILC2.

Ex vivo transmigration deneyinin başarısı için, lenfositlerin CCL17 ve CCL22'ye CCR4 ile yanıt verip vermediğini belirlemek zorunludur; bu nedenle hem CD4+ T hücrelerinde hem de ILC2'de ccr4 ekspresyonu akış sitometrisi ile belirledik. OVA'ya özgü CD4+ yardımcı T hücrelerinin CCR4'ü ifade ettiği iyi bilinmekle birlikte, ILC2'deki CCR4 ekspresyonu daha az bilinir. Şekil 1, erkek ve dişi, OVA-meydan okuyan BALB/c farelerinden CD4+ T hücrelerinde(Şekil 1A,C)ve ILC2(Şekil 1B,D)CCR4 ekspresyonunun temsili sonuçlarını göstermektedir. Akış sitometrisi allofikomisin (APC) konjuge monoklonal antikor kullanarak CCR4 saptanması için kullanılmıştır. Varyans Tek Yönlü Analizi (ANOVA) kullanarak, erkek ve kadın konaklar arasında CCR4 ekspresyonunda fark olmadığını belirledik(Şekil 1A–D),ancak ILC2'deki hücre bazında (MFI) CCR4 ifadesi CD4'e göre daha yüksekti + T hücreleri (Şekil 1C Ile Karşılaştırıldığında Şekil 1C). Bu sonuçlar, ilc2 ve CD4+ T hücrelerinin aşağıdaki deneyde CCL17 ve CCL22'ye yanıt vermesi gerektiğini göstermede önemlidir.

CD4+ T hücrelerinin bir transmigration sisteminin üst ve alt odalarındaKI CCR4 ligandlarına duyarlılığı.

ERKEK, OVA-meydan balb/c farelerinden CD4+ T hücreleri akciğerlerden ve dalaklardan izole edilerek 3 μM gözenekli membran ile ayrılmış bir transmigration cihazının üst haznesine yerleştirildi (Şekil 2). OVA ile tedavi edilen farelerin in vivo hazırlanmasının bir özeti(Şekil 2A) ve transmigration prosedürü(Şekil 2B)referans olarak gösterilmiştir. CCL17 (25 ng/mL) ve CCL22 (25 ng/mL) kombinasyonu, üst hazneye, alt ve alt bölmelere yerleştirildi ve(Şekil 2C),(1) OVA'ya meydan okuyan hayvanlardan cd4+ T hücrelerinin CCR4'e yanıt verdiğini doğrulamak için ligandlar ve (2) bu kemokin kaynaklı göç, T hücrelerinin keokin gradyan yanıt olarak gözenekleri ile hareket ettiği aktif bir süreç oldu, ve lenfositler kemokin bağımsız gözenekleri ile hareket değildi. CD4+ T hücrelerinin uyarılma olmadan 3 μM gözeneklerinden geçemeyeceğini göstermek için bir ortam (Kemokin yok) kontrolü eklenmiştir. Bu durumda, hücrelerin en yüksek yüzdesi üst odada kaldı. Kemokinler aynı anda üst ve alt hazneye yerleştirildiğinde, alt odadaki toplam T hücrelerinin %52'sini ve üst odadaki hücrelerin %48'ini tespit ettik (ÜST/ALT tedavi). Beklendiği gibi, kemokinin bulunduğu bölmedeki hücrelerin en yüksek yüzdesini tespit ettiğimiziçin, sadece üst veya sadece alt odaya yerleştirilen kemokine yanıt olarak hareket etti.

CD4+ T hücrelerinin ve ILC2'nin CCL17 ve CCL22'ye ex vivo transmigration aparatlarında duyarlılığı.

CD4 T hücreleri ve ILC2 erkek ve dişi, OVA-meydan fareler akciğerler ve dalak lar sonra bir transwell transmigration aparatÜst odasına yerleştirilir izole edildi(Şekil 3). Cihazın alt odası işlenmemiş hücre kültürü ortamı, CCL17 içeren ortam veya CCL22 içeren ortamlarla doluydu. Temsili sonuçlar% 14 'den az (13,37 + 6,5%) daha az olduğunu göstermektedir ortam kontrol koşullarında geçirilen hücrelerin(Şekil 3A-D). CCL22'ye yanıt olarak, her iki hücre tipi, ister erkek ister kadın konaklardan olsunlar, CCL22 'ye(Şekil 3A–D)yanıt verdi, ancak CCL17 sonuçları daha az tutarlıydı. CCL17 sadece kadın CD4 T hücreleri ve ILC2 için sadece medya ile karşılaştırıldığında önemli göç indüklenen(Şekil 3C,D). CCL17 tedavisi erkek CD4+ T hücreleri veya erkek ILC2(Şekil 3A,B)ve CCL22 erkek ILC2'de CCL17'den daha fazla göç emdirildi(Şekil 2B)için ortamdan farklı değildi.

Düşük canlılığa sahip CD4+ T hücreleri için suboptimal transmigration sonuçları.

Alt optimal sonuçlar, araştırmacıya, transmigration deneyi düzgün çalışmadığında neler beklenebilir bir örnek vermek için oluşturulmuştur(Şekil 4). Bu protokole göre erkeklerden cd4+ T hücrelerini izole ettik ve transmigration sisteminin en üst kuyusuna yerleştirdik. CD4+ T hücreleri eklendikten sonra plaka ilk 24 saat oda sıcaklığında kaldı, daha sonra plaka kuluçka döneminin kalan 24 saat için kuvöze taşındı. Beklendiği gibi, CCL17 ve CCL22(Şekil 4A)doğru hiçbir göç tespit ve hücrelerin canlılığı özellikle düşüktü (<15%) üstteki hücreler için (Şekil 4B). Bu hatalı sonuçlar, optimum sonuçlar elde etmek için bu protokolde ayrıntılı olarak belirtilen doğru sıcaklık ve koşulları kullanmanın önemini vurgular.

Figure 1
Şekil 1: CD4+ T hücreleri ve ILC2 ccr4 ifade. 7-9 haftalık, erkek ve kadın, BALB/c farelere bir kez 100 μL OVA-adsorbe ile alüminyum hidroksit enjekte edildi (500 μg/mL; OVA ve 20 mg/mL alüminyum hidroksit) ilk inden 7 gün önce 5, tekrarlayan, günlük hava yolu zorlukları ile 1.5% OVA tuzlu. Alerjene meydan okuyan hayvanlar insancıl bir şekilde ötenazi yapıldı ve ILC2 ve CD4+ T hücrelerinin izolasyonu için akciğer ve dalak dokusu toplandı. Hücrelerin küçük bir aliquot sonra lekeli ve her hücre tipinde CCR4 düzeyini belirlemek için akış sitometri tarafından analiz edildi. (A) CD4+ T hücrelerinin FREKANSI CCR4+ olan hücrelerin OVA+ farelerden, hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil ettiği (+ SEM). (B) CCR4+ (+SEM) olan ILC2 frekansı. (C, D) CCR4'ün ortalama floresan yoğunluğu (+SEM) on (C) CD4+ T hücreleri ve (D) ILC2. Bu verileri oluşturmak için toplam 13 fare kullanıldı ve akış deneyi iki kez tekrarlandı ve deney başına her bir tedavinin 3 kez tekrarlandı. Önemi Tek Yönlü ANOVA tarafından belirlendi; n.d. gruplar arasında herhangi bir fark olmadığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: CD4+ T hücrelerinin bir transmigration sisteminin üst ve alt odalarındaKI CCR4 ligandlarına duyarlılığı. Erkek BALB/c fareleri, tavuk yumurtası ovalbumin (OVA) ve CD4+ T hücreleri ile hassaslaştırılmış ve meydan okunmuş dalak ve akciğerlerden izole edilmiştir(A, B). Bu transmigration deneyi için CD4+ T hücreleri serumsuz ortamda 1 x 107 hücre/mL olarak askıya alındı. CCL17 ve CCL22 serumsuz ortama 50 ng/mL konsantrasyonla (her kemokinin 25 ng/mL'si toplam 50 ng/mL) olarak eklenmiştir. Kemokin içeren ortam sadece üst hazneye, sadece alt odaya veya hem üst hem de alt bölmelere eklenmiştir. Alt kuyulara toplam 500 μL'lik transmigration media hacmi eklendi ve üst kuyuya 100°L hücresel süspansiyon (1 x 106 hücre/kuyu) eklendi. Transmigration kültürde 48 saat sonra ölçüldü(C). Bu veriler tek bir deneyden elde edildi, doku toplama için 3 OVA ile tedavi edildi, erkek fareler kullanıldı ve tedavi başına 3 kopya üretildi. İstatistiksel anlamlılık Tek Yönlü ANOVA ile belirlendi; *p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: CD4+ T hücrelerinin ve ILC2'nin CCL17 ve CCL22'ye ex vivo transmigration aparatlarında duyarlılığı. Fareler CD4+ T hücresi ve ILC2 izolasyonu için Şekil 1'de olduğu gibi dalak ve akciğerlerden hazırlandı. CD4+ T hücreleri ve ILC2 serumsuz ortamda 1 x 107 hücre/mL olarak askıya alındı. CCL17 veya CCL22 serumsuz ortama 50 ng/mL konsantrasyonla eklendi. Alt kuyulara 500 μL transmigration media eklendi ve üst kuyuya 100°L hücresel süspansiyon (1 x 106 hücre/kuyu) eklendi. Göç kültürde 48 saat sonra ölçüldü. (A) CD4+ T hücreleri ve erkek konaklardan (B) ILC2 medya ile kontrol, CCL17 veya CCL22 olarak ele alındı. Benzer şekilde, (C) kadın CD4+ T hücreleri ve (D) kadın ILC2 media, CCL17 veya CCL22 ile tedavi edildi. Bu verileri oluşturmak için toplam 14 fare kullanıldı. Transmigration deneyi 4 kez tekrarlandı ve deney başına her tedavinin 3-6 kez tekrarlandı. Önemi Tek Yönlü ANOVA tarafından belirlendi; *p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Düşük canlılığa sahip CD4 T hücreleri için suboptimal transmigration sonuçları. Naif erkek BALB/c fareleri akciğer ve dalak doku toplama ve CD4+ T hücre izolasyonu için Şekil 1, Şekil 2ve Şekil 3'teolduğu gibi edinilmiştir. CD4 T hücreleri transmigration cihazının üst haznesine eklendi ve CCL17, CCL22 içeren serumsuz ortam veya alt kuyuya kemokin (medya kontrolü) eklendi. Deneyin ilk 24 saatiçin plaka oda sıcaklığında bırakılmış, daha sonra ek bir 24 saat için% 5 CO2 ile 37 °C inkübatör taşındı (A) 24 saat sonra üst ve alt kuyularda kalan hücrelerin yüzdesi 24 saat. (B) C canlılığı Kötü kuluçka koşullarını takiben üst ve alt odadaki D4+ T hücreleri. Bu veriler tek bir deneyden elde edildi, doku toplama için 3 saf erkek fare kullanıldı ve tedavi başına 3 kopya üretildi. İstatistiksel anlamlılık belirlenemedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, eksvivo transmigration sisteminde lenfositlerin kemokin kaynaklı göçlerini değerlendirmek için köklü bir yöntem sayılmiyoruz. Protokolde birkaç kritik adım vardır, bunlardan ilki deneydeki bağışıklık hücreleri üzerindeki doğru kemokin reseptörünün ekspresyonunu doğrulamaktır. Elimizde, biz alerjik inflamasyon Th2 yardımcı T hücrelerinde CCR4 önemini vurgulayan literatür vücut nedeniyle CCR4 seçti. Ovalbumin kaynaklı inflamasyon daha önce en az iki CCR4 antagonisti24,25; ancak, bu grup 2 doğuştan lenfoid hücrelerin keşfi nden önce (ILC2)26,27. ILC2 hücrelerinin CD4+ T hücrelerinden daha yüksek CCR4 ifade ettiğini gösteren yeni veriler oluşturduk ve bu hücrelerin CCL22'ye sürekli olarak yanıt verdiğini gösterdik.

Protokolde izlenir ikinci bir kritik adım, hücrelerin protokolün transmigration kısmına başlamadan önce kültür için optimum ortamda tutulmasını sağlamaktır. ILC2 durumunda, il-2 ve IL-33 hem içeren ILC2 Expansion Media bu hücreleri kültür vardı. IL-2 ve IL-7 14 gün28,29kadar kültür ILC2 desteklemek için literatürde bildirilmiştir. Canlılık cd4+ T hücreleri ve ILC2 gelecekteki deneylerde bir sorun haline gelirse, IL-2 veya IL-7 eklenmesi büyük olasılıkla deneyin bitiş noktasına kadar lenfositlerin sağkalım ını artıracaktır. Burada sunulan ortamların her biri çeşitli deneyler boyunca tanımlanmış ve bu protokol14,30,31kullanım için optimize edilebılmıştır. Şekil 4'teuygun sıcaklıkve %5 CO2ile bir kuvöz kullanmanın önemini göstermek için hatalı sonuçlar sunduk. Transmigration plakalarının kuvözde rahatsız edilmeyebilecekleri bir yerde tutulması protokolün başarısı için atılmış bir diğer kritik adımdır.

Daha önce de belirtildiği gibi, çoğu kurumda mevcut olan in vivo mikroskopinin kullanılmasının avantajları vardır, ancak in vivo görüntüleme zaman alıcı ve maliyetli olabilir. Daha az maliyetli alternatif bir deneysel prosedür lökosit ekstravasasyon ve doku göçü anlamak için keokin gradyanları ile birlikte mikroakışkankullanır32,33,34. Bu sistemler bilimsel değere sahipler çünkü endotel hücrelerini içeren hücre kinetiklerinin karmaşıklığını değerlendirirler, bu da mikroakışkan sistemlerin kılcal damarlarına kadar büyütülebilir. Ayrıca, bu mikroakışkan sistemler, kan akışı altında hücre yapışma sürecinde endotel hücreleri ve integrinler üzerinde bağlılık proteinlerinin (örneğin, E-kadherin) önemini değerlendirir. Yine de bu sistemler, her tedavi koşullarının önemini belirlemek için özel ekipman ve karmaşık hesaplamalı programlama ve istatistik gerektirir. Bu nedenle, burada sunulan transmigration yönteminin sınırlandırılması doğada yapay olduğu için, daha sonraki in vivo metotlarında gereksiz reaktiflerin israfını sınırlamak için önemli bir tarama aracı olarak kullanılabilir. Yöntemin önemi, ilc2'de olduğu gibi yeni hücreler keşfedildikçe, bu hücreleri bilinen kemokinlere duyarlılıkları açısından tarayabiliyoruz. Bu ilc2 ve astım alevlenme sırasında akciğerlere göç inhibe edebilir potansiyel tedaviler içeren gelecekteki uygulamalardan biridir. Bu transmigration protokolü, ILC2'nin işe alınmasında yer alan CCR4 veya diğer kemotaktik aracıları sınırlamak için kullanılabilecek çeşitli inhibitörleri taramak için kullanılacaktır. Bu ex vivo transmigration protokolü, gelecekteki in vivo deneyleri ile doğrulanabilecek kritik verilerin üretilmesine yol açacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken herhangi bir mali açıklama veya çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma Amerikan Akciğer Birliği (K.J.W.), T.A.W. ve K.J.W.'ye verilen Memorial Eugene Kenney fonu, Utah Üniversitesi'nden K.J.W. için cömert başlangıç desteği ve T.A.W. (VA I01BX0003635) gaziler bölümü tarafından finanse edilmiştir. T.A.W. Gaziler İşleri Bölümü'nden Bir Araştırma Kariyer Bilim Adamı Ödülü (IK6 BX003781) sahibidir. Yazarlar Bayan Lisa Chudomelka editoryal yardım kabul etmek istiyorum. Yazarlar bu makale için oluşturulan akış sitometri veri toplama destekiçin UNMC Akış Sitometri çekirdek teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich 15250061
1 mL syringe BD Bioscience 329424 U-100 Syringes Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine Gibco 10378-016 Dilute to 1x in RPMI media
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101 polypropylene tubes
3 μm transwell inserts Genesee Scientific 25-288 24-well plate containing 12 transwell inserts
3x stabilizing fixative BD Pharmigen 338036 Prepare 1x solution according to manufacturers protocol
5 mL polystyrene tubes STEM Cell Technologies 38007
50 mL conical tubes Olympus Plastics 28-106 polypropylene tubes
8-chamber easy separation magnet STEM Cell Technologies 18103
ACK Lysing Buffer Life Technologies Corporation A1049201
Advanced cell strainer, 40 μm Genesee Scientific 25-375 nylon mesh, 40 μm strainers
Aluminum Hydroxide, Reagent Grade Sigma-Aldrich 239186-25G 20 mg/mL
anti-mouse CCR4; APC-conjugated Biolegend 131211 0.5 μg/test
anti-mouse CD11b BD Pharmigen 557396 0.5 μg/test
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 Thermo-Fischer Scientific 61-0114-82 0.25 μg/test
anti-mouse CD16/32, Fc block BD Pharmigen 553141 0.5 μg/test
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated Thermo-Fischer Scientific 47-0193-82 0.5 μg/test
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated BD Pharmigen 552774 0.25 μg/test
anti-mouse CD45; PE conjugated BD Pharmigen 56087 0.5 μg/test
anti-mouse ICOS (CD278) BD Pharmigen 564070 0.5 μg/test
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated BD Pharmigen 553164 0.25 μg/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated Biolegend 145311 0.5 μg/test
Automated Cell Counter BIORAD 1450102
Automated Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich A2153-10G 0.5% in serum-free RPMI
Cell Counter Clides BIORAD 1450015
Chicken Egg Ovalbumin, Grade V Sigma-Aldrich A5503-10G 500 μg/mL
Collagenase, Type 1, Filtered Worthington Biochemical Corporation CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) 25 U/mL in RPMI
Compensation beads Affymetrix 01-1111-41 1 drop per contol tube
Dissociation Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-335
FACS Buffer BD Pharmigen 554657 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C
Heat Inactivated-FBS Genesee Scientific 25-525H 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
Mouse CCL17 GenScript Z02954-20 50 ng/mL
Mouse CCL22 GenScript Z02856-20 50 ng/mL
Mouse CD4+ T cell enrichment kit STEM Cell Technologies 19852
Mouse IL-2 GenScript Z02764-20 20 ng/mL
Mouse ILC2 enrichment kit STEM Cell Technologies 19842
Mouse recombinant IL-33 STEM Cell Technologies 78044 20 ng/mL
RPMI Life Technologies Corporation 22400071
Separation Buffer STEM Cell Technologies 20144 1x PBS + 2% FBS; stored at 4 °C
Small animal nebulizer and chamber Data Sciences International
Sterile saline Baxter 2F7124; NDC 0338-0048-04 0.9% Sodium Chloride

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 151 CCL17 (C-C Motif Kemokin 17)/TARC (timus ve aktivasyona bağlı kemokin) CCL22 (C-C Motif Kemokin 22)/MDC (Makrofaj kaynaklı kemokin) CCR4 (CCCc Kemokin Reseptör 4) CD4 T hücresi (CD4+ Thelper hücre)/Th2 hücre ILC2: (Grup 2 Doğuştan Lenfoid Hücre) OVA (Tavuk Yumurtaovalbumin)
Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, K. J., Wyatt, T. A.… More

Warren, K. J., Wyatt, T. A. Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System. J. Vis. Exp. (151), e60060, doi:10.3791/60060 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter