Single Cell Micro-Aspiration als Alternative zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung für die Trennung von Riesenviren
Summary
Hier beschreiben wir eine einzellige Mikro-Aspirationsmethode zur Trennung infizierter Amöben. Um virale Subpopulationen in Vermamoeba vermiformis zu trennen, die mit Faustoviren und unbekannten Riesenviren infiziert sind, haben wir das unten beschriebene Protokoll entwickelt und seine Fähigkeit demonstriert, zwei neuartige Riesenviren mit geringem Überfluss zu trennen.
Abstract
Während des Amöben-Cokulturprozesses kann mehr als ein Virus in einem einzigen Brunnen isoliert werden. Wir haben dieses Problem zuvor durch Endpunktverdünnung und/oder Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) gelöst, die auf die Viruspopulation angewendet wurde. Wenn die Viren in der Mischung jedoch ähnliche morphologische Eigenschaften haben und sich eines der Viren langsam vermehrt, wird das Vorhandensein von zwei Viren im Stadium der Genom-Montage entdeckt und die Viren können nicht für eine weitere Charakterisierung getrennt werden. Um dieses Problem zu lösen, haben wir ein einzelliges Mikro-Aspirationsverfahren entwickelt, das die Trennung und das Klonen von sehr ähnlichen Viren ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit stellen wir vor, wie diese alternative Strategie es uns ermöglichte, die kleinen viralen Subpopulationen des Clandestinovirus ST1 und des Usurpativirus LCD7 zu trennen, Riesenviren, die langsam wachsen und nicht zu Amöbenlyse im Vergleich zu der lytischen und schnell wachsenden Faustovirus. Die Reinheitskontrolle wurde durch spezifische Genverstärkung bewertet und Viren für die weitere Charakterisierung produziert.
Introduction
Nukleozytoplasmatische große DNA-Viren (NCLDV) sind extrem vielfältig und werden von vier Familien definiert, die Eukaryote infizieren1. Die ersten beschriebenen Viren mit Genomen über 300 kbp waren Phydcodnaviridae, einschließlich Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 PBCV12. Die Isolierung und die erste Beschreibung des Mimivirus zeigten, dass sich die Größe der Viren sowohl in Bezug auf die Größe des Teilchens (450 nm) als auch auf die Länge des Genoms (1,2 Mb)3verdoppelte. Seitdem wurden viele Riesenviren beschrieben, die in der Regel mit einem Amöben-Co-Kulturverfahren isoliert werden. Mehrere Riesenviren mit unterschiedlichen Morphologien und genetischen Inhaltsstoffen können aus Acanthamoeba sp. Zellen isoliert werden, einschließlich Marseilleviren, Pandoraviren, Pithoviren, Mollivirus, Cedratviren, Pacmanvirus, Tupanvirus und vor kurzem Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallel dazu ermöglichte die Isolierung von Vermamoeba vermiformis die Isolierung und Beschreibung der Riesenviren Faustovirus, Kaumoebavirus und Orpheovirus18,19,20. Andere Riesenviren wurden mit ihren Wirtsprotisten isoliert, wie Cafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23und Bodo saltans 24. Alle diese Isolationen waren das Ergebnis einer wachsenden Anzahl von Teams, die an der Isolation arbeiten, und der Einführung von Strategieaktualisierungen mit hohem Durchsatz25,26,27,28, wie z. B. Verbesserung des Cokultursystems durch den Einsatz von Durchflusszytometrie.
Im Jahr 2016 haben wir eine Strategie verwendet, die Co-Kultur und Durchflusszytometrie assoziiert, um Riesige Viren zu isolieren27. Diese Strategie wurde entwickelt, um die Anzahl der geimpften Proben zu erhöhen, Protisten, die als Zellstützen verwendet werden, zu diversifizieren und die Lyse der Zellunterstützung schnell zu erkennen. Das System wurde durch hinzufügen eines zusätzlichen Schritts aktualisiert, um eine vorläufige molekularbiologische Identifizierung und schnellen Nachweis einer unbekannten Viruspopulation wie im Fall von Pacmanvirus29zu vermeiden. Die Kopplung der Durchflusszytometrie zur Zellsortierung ermöglichte die Trennung einer Mischung aus Mimivirus und Cedratvirus A1130. Später stießen wir jedoch auf die Grenzen der Trennung und Detektion dieser viralen Subpopulationen durch Durchflusszytometrie. Nach der Sequenzierung, als wir die Genome des Faustovirus ST125 und des Faustovirus LCD7 (unveröffentlichte Daten) zusammenstellten, fanden wir in jeder Baugruppe überraschenderweise zwei zusätzliche Genome von zwei neuartigen Viren, die in öffentlichen Genomdatenbanken nicht identifiziert wurden. Weder die Durchflusszytometrie noch die transmissionselektronische Mikroskopie (TEM) zeigten jedoch, dass die Amöben mit zwei verschiedenen Viren infiziert waren, dem Clandestinovirus ST1 und dem Usurpativirus LCD7. Wir haben spezielle PCR-Systeme entwickelt, um Faustovirus, Usurpativirus und Clandestinovirus-Marker auf der Grundlage ihrer Genome zu verstärken; Unser Ziel war es, PCR-basierte Systeme zu haben, die eine Überprüfung der Reinheit der zu trennenden Viren ermöglichen. Die Endpunktverdünnung und die Durchflusszytometrie konnten sie jedoch nicht trennen. Die Isolierung dieser einzelnen Viruspopulation war schwierig, da weder die Morphologie noch die replizierenden Elemente der Populationen des Clandestinovirus und des Usurpativirus charakterisiert wurden. Wir haben aufgrund der Überlappung der beiden Populationen (getestet nach der effektiven Trennung) nur eine Viruspopulation durch Durchflusszytometrie festgestellt. Wir haben versucht, sie mit einer einzigen Partikelsortierung auf 96-Well-Platten zu trennen, aber wir haben keine zytopathischen Effekte beobachtet, und wir haben weder Clandestinovirus noch Usurpativirus durch PCR-Verstärkung entdeckt. Schließlich war es nur die Kombination der Endpunktverdünnung gefolgt von einem einzigen Amöben-Mikro-Aspiration, die die Trennung dieser beiden mit geringer Häufigkeit reichenden Riesenviren von Faustoviren ermöglichte. Diese Trennungsmethode ist Gegenstand dieses Artikels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Dauer der einzelzelligen Mikroaspirationsbehandlung und ihre gute Funktion ist bedienerabhängig. Die verschiedenen Schritte des Experiments erfordern Präzision. Die Verwendung der Mikromanipulationskomponenten des Arbeitsplatzes muss durch die Beobachtung des Prozesses der Mikroaspiration und der Freisetzung der Zelle ständig kontrolliert werden. Die Nachbeobachtung durch mikroskopische Beobachtung ist für die Erfassung und Übertragung einer Zelle notwendig. Ein erfahrener Bediener kann 1 bis 2 h nehmen, um 10 Z…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken sowohl Jean-Pierre Baudoin als auch Olivier Mbarek für ihren Rat und Claire Andréani für ihre Hilfe bei englischen Korrekturen und Modifikationen. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des französischen Staates unterstützt, das von der Nationalen Forschungsagentur im Rahmen des Programms “Investissements d’avenir (Investitionen für die Zukunft)” mit der Referenz ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée Infection) und von Région Provence Alpes verwaltet wurde. Céte d’Azur und europäische Finanzierung FEDER PRIMI.
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
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