巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引
Summary
ここでは、感染アメーバの分離のための単一細胞マイクロ吸引法について説明する。ファウストウイルスと未知の巨大ウイルスに感染したヴェルマメーバ・バーミフォルミスのウイルス亜集団を分離するために、以下に詳述するプロトコルを開発し、2つの低存在量の新規巨大ウイルスを分離する能力を実証した。
Abstract
アメーバ共培養プロセス中に、複数のウイルスを単一のウェルで単離してもよい。我々は以前、ウイルス集団に適用される終点希釈および/または蛍光活性化細胞選別(FACS)によってこの問題を解決した。しかし、混合物中のウイルスが類似した形態学的特性を有し、ウイルスの1つがゆっくりと増殖すると、ゲノムアセンブリの段階で2つのウイルスの存在が発見され、ウイルスはそれ以上の特徴付けのために分離することができない。この問題を解決するために、類似性の高いウイルスの分離とクローニングを可能にする単一細胞マイクロ吸引手順を開発しました。本研究では、この代替戦略により、クランデスチノウイルスST1とウスルパティウイルスLCD7の小さなウイルス亜集団を分離し、ゆっくりと成長し、溶解性および急速に成長するアメーバル溶解に至らない巨大ウイルスをどのように分離することができたかを提示する。ファウストウイルス。純度制御は、特異的遺伝子増幅によって評価され、ウイルスはさらに特徴付けのために産生された。
Introduction
核細胞質大DNAウイルス(NCLDV)は、真核生物1に感染する4つのファミリーによって定義される非常に多様である。300kbpを超えるゲノムを有する最初の記載のウイルスはフィコドナウイルス科、パラメシウムブルサリアクロレラウイルス1 PBCV12を含む。MimiVirusの単離および最初の説明は、ウイルスの大きさが粒子の大きさ(450nm)とゲノムの長さ(1.2Mb)3の両方の点で倍増することを示した。それ以来、多くの巨大ウイルスが記載されており、通常はアメーバ共培養手順を用いて単離される。異なる形態と遺伝的内容を持ついくつかの巨大なウイルスは、マルセイユウイルス、パンドラウイルス、ピトウイルス、モリウイルス、セドラットウイルス、パックマンウイルス、トゥパンウイルス、および最近を含むアカントアメーバ球細胞から単離することができるメデューサウイルス4,5,6,7,8,9,10,11,12,13、14、15、16、17.並行して、ベルマモエバ・バーミフォルミスの単離により、ファウストウイルス、カウモエバウイルス、およびオルフェオウイルス18、19、20の巨大ウイルスの単離および説明が可能となった。他の巨大ウイルスは、カフェテリア・レンゲンシス21、アウレオコッカス・アノファゲフェレンス22、クリソクロムリナ・エリチナ23、ボド・サルタンなどの宿主プロティストと共に単離された。 24.これらの分離はすべて、分離に取り組むチームの数が増え、高スループット戦略の更新が導入された結果です。フローサイトメトリーを用いる共培養システムの改善
2016年には、共培養とフローサイトメトリーを関連付ける戦略を用いて巨大ウイルス27を単離しました。この戦略は、接種するサンプルの数を増やし、細胞支持体として使用されるプロティストを多様化し、細胞支持体の上昇を迅速に検出するために開発されました。システムは、Pacmanvirus29の場合のように、予備的な分子生物学の同定と未知のウイルス集団の迅速な検出を避けるために補足ステップを追加することによって更新された。細胞選別への結合フローサイトメトリーは、ミミウイルスとセドラトウイルスA1130の混合物の分離を可能にする。しかし、後にフローサイトメトリーによるこれらのウイルス亜集団の分離と検出の限界に遭遇しました。シーケンシング後、ファウストウイルスST125とファウストウイルスLCD7(未発表データ)のゲノムを組み立てたとき、公共ゲノムデータベースで同定されていない2つの新規ウイルスの2つの補足ゲノムを各アセンブリで驚くほど見つけました。しかし、フローサイトメトリーも透過電子顕微鏡(TEM)も、アメーバが2つの異なるウイルス、クランデスチノウイルスST1およびウスルパティウイルスLCD7によって感染していることを示さなかった。我々は、ファウストウイルス、ウスルパティウイルス、クランデスチノウイルスマーカーをそれぞれゲノムに基づいて増幅する特定のPCRシステムを設計した。私たちの目的は、分離されているウイルスの純度の検証を可能にするPCRベースのシステムを持つことです。しかし、終点希釈とフローサイトメトリーはそれらを分離できませんでした。クランデスチノウイルスおよびウスルパティウイルス集団の形態および複製要素のいずれも特徴付けされていないため、この単一のウイルス集団の分離は困難であった。2つの集団の重複(有効分離後に試験)により、フローサイトメトリーによってウイルス集団を1つだけ検出した。96ウェルプレート上で単一粒子選別を行って分離しようとしましたが、細胞障害効果は観測されず、PCR増幅によってクランデスチノウイルスもウスルパティウイルスも検出しませんでした。最後に、エンドポイント希釈の組み合わせのみに続いて、ファウストウイルスからこれら2つの低存在量の巨大ウイルスの分離を可能にした単一のアメーバマイクロ吸引の組み合わせだけでした。この分離方法は、この資料の対象です。
Protocol
Representative Results
Discussion
単一細胞マイクロ吸引処理の持続時間および良好な機能はオペレータに依存する。実験の異なるステップは、精度を必要とします。ワークステーションのマイクロ操作コンポーネントの使用は、マイクロ吸引のプロセスと細胞の放出を観察することによって一定の制御下になければなりません。顕微鏡観察によるフォローアップは、細胞の捕獲と移動に必要です。経験豊富なオペレータは、1…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、ジャン=ピエール・ボードゥアンとオリヴィエ・ムバレクのアドバイスとクレア・アンドレアニの英語の修正と修正に関する彼女の助けに感謝したいと思います。この作品は、ANR-10-IAHU-03(メディテラネ感染症)とレジオン・プロヴァンス・アルプを参照する「投資・ダベニール(未来への投資)」プログラムの下で、国家研究機関が管理するフランス国家からの助成金によって支援されました。コートダジュールとヨーロッパの資金調達フェデラープリミ。
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
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