תא בודד מיקרו-שאיפה כאסטרטגיה חלופית מיון תאים פלואורסצנטית מופעל עבור הפרדה וירוס ענק תערובת
Summary
כאן, אנו מתארים שיטת מיקרו-השאיפה תא אחד להפרדה של אמבות נגוע. על מנת להפריד אוכלוסיות משנה ויראלי ב Vermamoeba vermiformis נגוע על ידי פאוסטווירוסים ווירוסים ענקיים לא ידוע, פיתחנו את הפרוטוקול מפורט להלן והפגינו את יכולתה להפריד בין שני שפע ווירוסים ענק הרומן.
Abstract
במהלך התהליך שיתוף תרבות אמבה, יותר מווירוס אחד יכול להיות מבודד באר אחת. בעבר פתרנו את הבעיה הזאת באמצעות דילול נקודת הסיום ו/או מיון התא המופעל על ידי הזריחה (FACS) שהוחלו על האוכלוסייה הנגיפית. עם זאת, כאשר וירוסים בתערובת יש תכונות דומות מורפולוגיים ואחד הווירוסים מכפיל לאט, הנוכחות של שני וירוסים מתגלה בשלב של הרכבת הגנום והווירוסים לא ניתן להפריד לאפיון נוסף. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו תא בודד השאיפה מיקרו הליך המאפשר הפרדה ושיבוט של וירוסים דומים מאוד. בעבודה הנוכחית, אנו מציגים כיצד אסטרטגיה חלופית זו אפשרה לנו להפריד את האוכלוסיות הקטנות ויראליות של הST1 וירוס מLCD7, וירוסים ענקיים הגדלים לאט ואינם מובילים לליזה אמבות בהשוואה לליטיק ולגידול מהיר . וירוס פאוסטוו בקרת טוהר הוערך על ידי הגברה גנטית ספציפיים ווירוסים יוצרו לאפיון נוסף.
Introduction
נוקלאוציטופטוצימיק וירוסי DNA גדולים (NCLDV) הם מגוונים ביותר, המוגדרים על ידי ארבע משפחות להדביק eukaryotes1. הווירוסים הראשונים שתוארו עם גנום מעל 300 kbp היו phyd,כולל הנגיף כלורלה בורסאריה 1 PBCV12. הבידוד והתיאור הראשון של Mimivirus, הראה כי הגודל של וירוסים הוכפל במונחים של גודל של החלקיק (450 ננומטר) ואת אורך הגנום (1.2 Mb)3. מאז, וירוסים ענקיים רבים תוארו, בדרך כלל מבודדים באמצעות שיתוף תרבות אמבה הליך. כמה וירוסים ענקיים עם מורפולוגיות שונות ותכנים גנטיים יכולים להיות מבודדים מתאי האקאטאמבה sp., כולל Marseilleviruses, פנדוראוירוסים, Pithoviruses, Mollivirus ירוס, Cedratviruses, Pacmanvirus ירוס, tupanvirus, ולאחרונה וירוס4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. במקביל, הבידוד של vermamoeba vermiformis מותר בידוד ותיאור של וירוסים ענקיים faustovirus, kaumoebavirus, ו orpheovirus18,19,20. וירוסים ענקיים אחרים היו מבודדים עם protists המארחים שלהם, כגון קפטריה roenbergensis21, האוראוקוקוס anopהגאולה22, כריזוכרומלינה אבינה23, ו bodo saltans . עשרים וארבע כל הבודדים האלה היו תוצאה של מספר גדל והולך של צוותים העובדים על בידוד והמבוא של עדכוני אסטרטגיית תפוקה גבוהה25,26,27,28, כגון ה שיפור של מערכת שיתוף התרבות עם השימוש של cy, הזרמת הזרימה.
ב 2016, השתמשנו אסטרטגיה שיוך שיתוף התרבות והזרימה cy, נסה לבודד וירוסים ענקיים27. אסטרטגיה זו פותחה כדי להגדיל את מספר הדגימות מחוסן, כדי לגוון הפרולנים המשמשים כתומך התא, וכדי לזהות במהירות את הליזה של תמיכת התא. המערכת עודכנה על ידי הוספת צעד משלים כדי למנוע זיהוי ראשוני הביולוגיה המולקולרית וזיהוי מהיר של אוכלוסיה נגיפית לא ידוע כמו במקרה של Pacmanvirus29. הזיווגים זרימה cy, לנסות מיון התא מותר להפרדה של תערובת של Mimivirus ו Cedratvirus A1130. עם זאת, נתקלנו מאוחר יותר במגבלות של הפרדה וגילוי של אוכלוסיות משנה ויראליות אלה על ידי זרימה cy, לנסות. לאחר ברצף, כאשר הרכבנו את גנום של faustovirus ST125 ו faustovirus LCD7 (נתונים שלא פורסמו), אנו מוצאים במפתיע בכל הרכבה שני גנום משלים של שני וירוסים רומן לא מזוהה במסדי נתונים הגנום הציבורי. עם זאת, לא להזרים cy, או מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) הראו כי האמבות היו נגועים על ידי שני וירוסים שונים, ST1 הנגיף ו לחאבפטיב LCD7. עיצבנו מערכות PCR ספציפיות כדי להגביר את הנגיף, את הנגיף ואת סמני הפינווירוס בהתאמה על בסיס הגנום שלהם; המטרה שלנו הייתה לקבל מערכות מבוססות PCR המאפשרות אימות של טוהר הווירוסים המופרדים. עם זאת, דילול הנקודה הסופית והזרימה cyאני try לא הצליחו להפריד ביניהם. הבידוד של האוכלוסייה הנגיפית היחידה הזאת היה קשה משום שלא התאפיין במרכיבים מורפולוגיה ולא מרכיבים מחקריים של אוכלוסיות הנגיף והליפאיות. גילינו רק אוכלוסייה אחת ויראלית על ידי זרימה cy, לנסות בגלל חופפים של שתי האוכלוסיות (נבדק לאחר ההפרדה האפקטיבית). ניסינו להפריד ביניהן באמצעות מיון חלקיקים אחד על 96-צלחות, אבל לא הבחנו בשום השפעות סייטואטמית, ולא גילינו את ההשפעות השליליות של הנגיף או החאפיפטיו על ידי ה-PCR. לבסוף, זה היה רק שילוב של דילול נקודת הקצה ואחריו אמבה מיקרו-שאיפה אחת הזמינה הפרדה של שני אלה נמוכה שפע וירוסים ענקיים מן פאוסטוירוסים. שיטת הפרדה זו היא האובייקט של מאמר זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
משך הטיפול במיקרו-שאיפה התא היחיד ותפקודו התקין הוא תלוי-מרכזיה. השלבים השונים של הניסוי דורשים דיוק. השימוש ברכיבי המיקרומניפולציה של תחנת העבודה חייב להיות תחת שליטה מתמדת על-ידי התבוננות בתהליך של שאיפה מיקרו ושחרורו של התא. המעקב אחר התבוננות מיקרוסקופית הוא הכרחי ללכידה והעברה של תא…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות גם לג פייר בודואן ולאוליביה מבארק על העצה שלהם ועל קלייר אנדראני על עזרתה בתיקונים ושינויים באנגלית. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמדינה הצרפתית מנוהלת על ידי סוכנות המחקר הלאומית תחת “מחקר השקעות לעתיד” התוכנית עם התייחסות ANR-10-IAHU-03 (זיהום מסיבי) ועל ידי Région פרובנס אלפ קוט ד’אזור והמימון האירופאי פדר PRIMI.
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
- Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
- Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
- Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033 (2003).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
- Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
- Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).
- Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).
- Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300 (2016).
- Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372 (2018).
- Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
- Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
- Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76 (2016).
- Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
- Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).
- Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
- Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278 (2016).
- Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).
- Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
- Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
- Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235 (2018).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
- Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).
- Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).
- Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
- Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
- Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).
- Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).
- Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).
