Одноклеточная микро-аспирация в качестве альтернативной стратегии для флуоресценции активированной сортировки клеток для гигантского разделения вирусной смеси
Summary
Здесь мы описываем метод микроаспирации одной клетки для разделения инфицированных амеб. Для того, чтобы отделить вирусные субпопуляции в Vermamoeba vermiformis, инфицированных faustoviruses и неизвестных гигантских вирусов, мы разработали протокол подробно ниже и продемонстрировали его способность отделить два низкого изобилия новых гигантских вирусов.
Abstract
Во время процесса кокультуры амебы, более одного вируса могут быть изолированы в одном колодце. Ранее мы решили эту проблему путем разбавления конечных точек и/или флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS), применяемой к вирусной популяции. Однако, когда вирусы в смеси имеют схожие морфологические свойства и один из вирусов размножается медленно, наличие двух вирусов обнаруживается на стадии сборки генома и вирусы не могут быть разделены для дальнейшей характеристики. Чтобы решить эту проблему, мы разработали процедуру микроаспирации, которая позволяет отделять и клонировать очень похожие вирусы. В настоящей работе мы представляем, как эта альтернативная стратегия позволила нам отделить небольшие вирусные субпопуляции clandestinovirus ST1 и Usurpativirus LCD7, гигантские вирусы, которые растут медленно и не приводят к амебальному лисису по сравнению с литиком и быстрорастущим Фаустовирус. Контроль чистоты оценивался по специфическим усиливанию генов, и для дальнейшей характеристики были созданы вирусы.
Introduction
Нуклеоцитоплазмамические крупные ДНК-вирусы (NCLDV) чрезвычайно разнообразны, определяемые четырьмя семьями, которые заражают эукариоты1. Первые описанные вирусы с геномами выше 300 кбит/с были Phydcodnaviridae, в том числе Paramecium бурсария хлореллы вирус 1 PBCV12. Изоляция и первое описание Мимивируса, показали, что размер вирусов удвоился как с точки зрения размера частицы (450 нм) и длины генома (1,2 Мб)3. С тех пор многие гигантские вирусы были описаны, как правило, изолированы с помощью амебы совместной культуры процедуры. Несколько гигантских вирусов с различными морфологиями и генетическим содержанием могут быть выделены из клеток Acanthamoeba sp., включая Марсельскиевирусы, Пандоравирусы, Питховирусы, Молливирус, Седратвирусы, Pacmanvirus, Tupanvirus, и в последнее время Медузавирус4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Параллельно изоляция Vermamoeba vermiformis позволила изоляции и описания гигантских вирусов Faustovirus, Kaumoebavirus, и Орфеовирус18,19,20. Другие гигантские вирусы были изолированы с их принимающей протеистов, таких как кафетерий roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23, и Бодо saltans 24. Все эти изоляции были результатом увеличения числа групп, работающих над изоляцией и введением обновлений стратегии высокой пропускной связи25,26,27,28,таких как улучшение системы совместной культуры с использованием цитометрии потока.
В 2016 году мы использовали стратегию, связывающую кокультуру и цитометрию потока, чтобы изолировать гигантские вирусы27. Эта стратегия была разработана для увеличения количества образцов, чтобы диверсифицировать протистов, используемых в качестве клеточных опор, и быстро обнаружить лиза клеточной поддержки. Система была обновлена путем добавления дополнительного шага, чтобы избежать предварительной молекулярной биологии идентификации и быстрого обнаружения неизвестной вирусной популяции, как в случае Pacmanvirus29. Соединение цитометрии потока к сортировке клеток позволило разделить смесь мимивируса и седратвируса А1130. Однако позже мы столкнулись с ограничениями разделения и обнаружения этих вирусных субпопуляций цитометрией потока. После секвенирования, когда мы собрали геномы Faustovirus ST125 и Faustovirus LCD7 (неопубликованные данные), мы удивительно обнаружили в каждой сборке два дополнительных генома двух новых вирусов, не идентифицированных в базах данных общественного генома. Однако ни цитометрия потока, ни электронная микроскопия передачи (ТЭМ) не показали, что амебы были заражены двумя различными вирусами: Clandestinovirus ST1 и Usurpativirus LCD7. Мы разработали специальные ПЦР-системы для усиления маркеров Фаустовируса, Усурпативируса и кландедестовируса соответственно на основе их геномов; нашей целью было наличие систем на основе ПЦР, которые позволяют проверить чистоту разделенных вирусов. Однако, конечная точка разбавления и потока цитометрии не удалось разделить их. Изоляция этой единственной вирусной популяции была трудной, поскольку ни морфология, ни репликационные элементы популяций кландестовируса и узурпативируса не были охарактеризованы. Мы обнаружили только одну вирусную популяцию цитометрией потока из-за перекрытия двух популяций (проверено после эффективного разделения). Мы пытались разделить их с помощью сортировки одной частицы на 96-колодцах пластинах, но не наблюдали никаких цитопатических эффектов, и мы не обнаружили ни кландестовируса, ни усурпативируса при усилении ПЦР. Наконец, только сочетание разбавления конечной точки, за которым последовало микроапиратное амеба, позволило отделить эти два гигантских вируса с низким изобилием от фаустовирусов. Этот метод разделения является объектом этой статьи.
Protocol
Representative Results
Discussion
Продолжительность обработки микроаспирации одной ячейки и ее хорошее функционирование зависят от оператора. Различные этапы эксперимента требуют точности. Использование микроманипуляций компонентов рабочей станции должно находиться под постоянным контролем, наблюдая за процессом…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить как Jean-Pierre Baudoin, так и Оливье Мбарек за их советы и Клэр Андреани за ее помощь в коррекции и модификации английского языка. Эта работа была поддержана грантом от французского государства, управляемым Национальным исследовательским агентством в рамках программы «Инвестиции в будущее» с помощью anR-10-IAHU-03 (Инфекция Медитерране) и Региона Провансальских Альп Лазурный берег и европейское финансирование FEDER PRIMI.
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
- Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
- Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
- Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033 (2003).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
- Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
- Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).
- Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).
- Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300 (2016).
- Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372 (2018).
- Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
- Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
- Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76 (2016).
- Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
- Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).
- Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
- Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278 (2016).
- Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).
- Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
- Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
- Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235 (2018).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
- Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).
- Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).
- Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
- Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
- Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).
- Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).
- Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).
