Microaspiración de células únicas como estrategia alternativa a la clasificación celular activada por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes
Summary
Aquí, describimos un método de microaspiración de una sola célula para la separación de las amebas infectadas. Con el fin de separar subpoblaciones virales en Vermamoeba vermiformis infectados por Faustovirus y virus gigantes desconocidos, desarrollamos el protocolo detallado a continuación y demostramos su capacidad para separar dos nuevos virus gigantes de baja abundancia.
Abstract
Durante el proceso de cocultura de la ameba, más de un virus puede aislarse en un solo pozo. Hemos resuelto previamente este problema por dilución de punto final y/o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) aplicada a la población viral. Sin embargo, cuando los virus de la mezcla tienen propiedades morfológicas similares y uno de los virus se multiplica lentamente, se descubre la presencia de dos virus en la etapa de montaje del genoma y los virus no se pueden separar para una caracterización posterior. Para resolver este problema, desarrollamos un procedimiento de microaspiración de una sola célula que permite la separación y clonación de virus altamente similares. En el presente trabajo, presentamos cómo esta estrategia alternativa nos permitió separar las pequeñas subpoblaciones virales de Clandestinovirus ST1 y Usurpativirus LCD7, virus gigantes que crecen lentamente y no conducen a la lisis amebal en comparación con el lítico y el crecimiento rápido Faustovirus. El control de pureza se evaluó mediante amplificación genética específica y se produjeron virus para su posterior caracterización.
Introduction
Los virus nucleocitoplasmáticos de ADN grande (NCLDV) son extremadamente diversos, definidos por cuatro familias que infectan los eucariotas1. Los primeros virus descritos con genomas superiores a 300 kbps fueron Phydcodnaviridae, incluido el virus de la Clorella de paramecículo bursario 1 PBCV12. El aislamiento y la primera descripción de Mimivirus, mostraron que el tamaño de los virus se duplicó tanto en tamaño de la partícula (450 nm) como en la longitud del genoma (1,2 Mb)3. Desde entonces, se han descrito muchos virus gigantes, generalmente aislados mediante un procedimiento de cocultura de ameba. Varios virus gigantes con diferentes morfologías y contenidos genéticos pueden ser aislados de células sp. de Acanthamoeba, incluyendo Marsellavirus, Pandoravirus, Pithovirus, Mollivirus, Cedratvirus, Pacmanvirus, Tupanvirus, y recientemente Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Paralelamente, el aislamiento de Vermamoeba vermiformis permitió el aislamiento y la descripción de los virus gigantes Faustovirus, Kaumoebavirus y Orfeovirus18,19,20. Otros virus gigantes fueron aislados con sus protistas huéspedes, como Cafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina 23 y Bodo saltans 22 , Chrysochromulina ericina23y Bodo saltans 24. Todos estos aislamientos fueron el resultado de un número cada vez mayor de equipos que trabajan en el aislamiento y la introducción de actualizaciones de estrategia de alto rendimiento25,26,27,28, como el mejora del sistema de cocultura con el uso de citometría de flujo.
En 2016, utilizamos una estrategia que asocia baña cocultivo y citometría de flujo para aislar virus gigantes27. Esta estrategia fue desarrollada para aumentar el número de muestras inoculadas, para diversificar protistas utilizados como soportes celulares, y para detectar rápidamente la lisis del soporte celular. El sistema se actualizó añadiendo un paso suplementario para evitar la identificación preliminar de la biología molecular y la detección rápida de una población viral desconocida como en el caso de Pacmanvirus29. La citometría de flujo de acoplamiento a la clasificación celular permitió la separación de una mezcla de Mimivirus y Cedratvirus A1130. Sin embargo, más tarde encontramos las limitaciones de la separación y detección de estas subpoblaciones virales por citometría de flujo. Después de la secuenciación, cuando ensamblamos los genomas de Faustovirus ST125 y Faustovirus LCD7 (datos no publicados), sorprendentemente encontramos en cada conjunto dos genomas suplementarios de dos virus novedosos no identificados en bases de datos públicas del genoma. Sin embargo, ni la citometría de flujo ni la microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostraron que las amebas estaban infectadas por dos virus diferentes, Clandestinovirus ST1 y Usurpativirus LCD7. Diseñamos sistemas de PCR específicos para amplificar los marcadores Defaustovirus, Usurpativirus y Clandestinovirus, respectivamente, en función de sus genomas; nuestro propósito era tener sistemas basados en PCR que permitieran verificar la pureza de los virus separados. Sin embargo, la dilución de punto final y la citometría de flujo no pudieron separarlos. El aislamiento de esta única población viral fue difícil porque no se han caracterizado ni la morfología ni los elementos replicativos de las poblaciones de Clandestinovirus y Usurpativirus. Detectamos sólo una población viral por citometría de flujo debido a la superposición de las dos poblaciones (probada después de la separación efectiva). Tratamos de separarlos usando una sola partícula de clasificación en placas de 96 pocillos, pero no observamos ningún efecto citopático, y no detectamos Clandestinovirus ni Usurpativirus por amplificación de PCR. Por último, fue sólo la combinación de dilución de punto final seguida de una sola microaspiración de amebas lo que permitió la separación de estos dos virus gigantes de baja abundancia de Faustovirus. Este método de separación es el objeto de este artículo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La duración del manejo de la microaspiración de una sola célula y su buen funcionamiento depende del operador. Los diferentes pasos del experimento requieren precisión. El uso de los componentes de micromanipulación de la estación de trabajo debe estar bajo control constante observando el proceso de microaspiración y la liberación de la célula. El seguimiento por observación microscópica es necesario para la captura y transferencia de una célula. Un operador experimentado puede tomar de 1 a 2 h para aislar 10…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a Jean-Pierre Baudoin y Olivier Mbarek por sus consejos y a Claire Andréani por su ayuda en correcciones y modificaciones en inglés. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Estado francés gestionada por la Agencia Nacional de Investigación en el marco del programa “Investissements d’avenir (Inversiones para el Futuro)” con la referencia ANR-10-IAHU-03 (Infección Méditerranée) y por Région Alpes Provence Provence Costa Azul y financiación europea FEDER PRIMI.
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
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