خليه واحده الطموح الصغير كاستراتيجية بديله لفرز الخلايا المنشطة الفلورية لفصل خليط الفيروسات العملاقة
Summary
هنا ، ونحن وصف خليه واحده الطموح الصغير طريقه للفصل بين الأميبا المصابة. [أين وردر تو] فصلت [سوببوبولايشن] فيروسية في [ فرماميبا] [فرميفورليس ] يعدي ب [فوستوفيروس] وحميات عملاقه مجهوله, طور نحن البروتوكول مفصل أدناه ويبرهن قدرته ان يفصل اثنان [لوو-فري] رواية فيروسات عملاقه.
Abstract
خلال عمليه الثقافة المشتركة الأميبا ، قد يتم عزل أكثر من فيروس واحد في بئر واحده. نحن في السابق حل هذه المسالة عن طريق تخفيف نقطه النهاية و/أو الفرز الخلية المنشطة (FACS) تطبيقها علي السكان الفيروسية. ومع ذلك ، عندما يكون للفيروسات في الخليط خصائص مورفولوجيك مماثله واحده من الفيروسات تتكاثر ببطء ، يتم اكتشاف وجود اثنين من الفيروسات في مرحله التجمع الجينوم والفيروسات لا يمكن فصلها لمزيد من التوصيف. ولحل هذه المشكلة ، قمنا بوضع اجراء أحادي الطموح للخلية يسمح بفصل واستنساخ فيروسات متشابهة للغاية. في هذا العمل ، نقدم كيف سمحت لنا هذه الاستراتيجية البديلة لفصل السكان الفرعيين الفيروسية الصغيرة من كلانديستينوفيروس ST1 والفيروسات المغتصبة LCD7 ، والفيروسات العملاقة التي تنمو ببطء ولا تؤدي إلى تحلل الأميبا بالمقارنة مع التحللي وسريع النمو فوستوفيروس. وتم تقييم الرقابة علي النقاء بواسطة تضخيم جيني محدد ، وأنتجت فيروسات لمزيد من التوصيف.
Introduction
الفيروسات الحمضية النووية الكبيرة النواة (NCLDV) متنوعة للغاية ، والتي تحددها أربع عائلات تصيب نواه النوى1. ووصفت الفيروسات الاولي مع الجينوم أعلاه 300 وكانت Phydcodnaviridae, بما في ذلك الفيروس بيرساريا شلوريلا باراسينيوم 1 PBCV12. العزلة والوصف الأول من Mimivirus ، وأظهرت ان حجم الفيروسات تضاعف من حيث حجم الجسيمات (450 نانومتر) وطول الجينوم (1.2 Mb)3. ومنذ ذلك الحين ، تم وصف العديد من الفيروسات العملاقة ، وعاده ما تكون معزولة باستخدام اجراء الأميبا الثقافة المشتركة. يمكن عزل العديد من الفيروسات العملاقة مع المتحولات المختلفة والمحتويات الوراثية من Acanthamoeba sp. الخلايا ، بما في ذلك مرسيليا ، الفيروسات Pandoraviruses ، الفيروسات ، الفيروسات ، الحمى الطفيلية ، الفيروسات ، ومؤخرا فيروس الورم النخاعي4،5،6،7،8،9،10،11،12، 13،14،15،16،17. في الوقت نفسه ، فان عزله vermamoeba vermamoeba يسمح العزلة ووصف الفيروسات العملاقة faustovirus ، kaumoebavirus ، و اورففيروس18،19،20. تم عزل الفيروسات العملاقة الأخرى مع الأطباء المضيفين ، مثل كافتيريا roenbergensis21، aureococcus أنوفاجيفيرينس22، تشريسوتشرومولينا اريك23، والقفطان بودو 24-الآن وكانت جميع هذه العزلات نتيجة لعدد متزايد من الفرق العاملة في العزل وإدخال تحديثات استراتيجية الانتاجيه العالية25،26،27،28، مثل تحسين نظام الثقافة المشتركة مع استخدام التدفق الخلوي.
في 2016 ، استخدمنا استراتيجية ربط الثقافة المشتركة وتدفق الخلوية لعزل الفيروسات العملاقة27. وقد وضعت هذه الاستراتيجية لزيادة عدد العينات الملقحة ، ولتنويع الأطباء الداعمين المستخدمين كدعامات للخلايا ، وللكشف بسرعة عن تحلل دعم الخلايا. تم تحديث النظام عن طريق أضافه خطوه اضافيه لتجنب تحديد البيولوجيا الجزيئية الاوليه والكشف السريع عن السكان الفيروسية غير معروف كما هو الحال في Pacmanvirus29. اقتران تدفق الخلوي لفرز الخلايا يسمح للفصل بين خليط من Mimivirus و Cedratvirus A1130. ومع ذلك ، واجهنا في وقت لاحق قيود الانفصال والكشف عن هذه السكان الفرعية الفيروسية عن طريق تدفق الخلوي. بعد التسلسل ، عندما جمعنا الجينوم من Faustovirus ST125 و FAUSTOVIRUS LCD7 (البيانات غير المنشورة) ، وجدنا بشكل مدهش في كل تجميع اثنين من الجينوم التكميلي لفيروسين جديدين لم يتم تحديدهما في قواعد بيانات الجينوم العام. ومع ذلك ، فان لا تدفق الخلوي ولا انتقال المجهر الكتروني (TEM) أظهرت ان الأميبا كانت مصابه بفيروسين مختلفين ، كلانديستينوفيروس ST1 و مغتصب الفيروسات LCD7. قمنا بتصميم أنظمه PCR محدده لتضخيم فوستوفيروس ، والفيروسات المغتصبة ، وعلامات كلانديستينوفيروس علي التوالي علي أساس الجينوم الخاصة بهم. كان هدفنا ان يكون النظام القائم علي PCR التي تمكن التحقق من نقاء الفيروسات التي يتم فصلها. ومع ذلك ، فشل التخفيف نقطه النهاية والتدفق الخلوي للفصل بينهما. وكانت عزله هذه المجموعة الفيروسية الوحيدة صعبه لأنه لم يتم وصف العناصر المورفولوجية والمستنسخة لكلانديستينوفيروس والسكان المغتصبين. اكتشفنا واحد فقط من السكان الفيروسية من خلال تدفق الخلوية بسبب تداخل السكان اثنين (اختبار بعد الانفصال الفعلي). حاولنا فصلهم باستخدام واحد الجسيمات الفرز علي لوحات 96-حسنا ، ولكن لم نلاحظ اي اثار خلوي ، واكتشفنا لا كلانديستينوفيروس ولا مغتصب الفيروسات بواسطة PCR التضخيم. وأخيرا ، لم يكن سوي مزيج من تخفيف نقطه النهاية تليها الأميبا الصغيرة الطموح الذي مكن الفصل بين هذين الفيروسات العملاقة منخفضه الوفرة من فوستوفيروس. هذا الأسلوب للفصل هو الكائن من هذه المقالة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتتوقف مده معالجه الاستنشاق الدقيق للخلية الواحدة وأداءها الجيد علي المشغل. تتطلب الخطوات المختلفة للتجربة الدقة. يجب ان يكون استخدام مكونات المعالجة التفصيلية لمحطه العمل تحت السيطرة المستمرة من خلال مراقبه عمليه الطموح المتناهي الصغر وإطلاق الخلية. والمتابعة بالرصد المجهري ضرورية لل…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان ان يشكرا كلا من جان بيير باودوين واوليفييه مباريك علي مشورتهما وكلير اندرياني لمساعدتها في التصحيحات والتعديلات الانكليزيه. وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من الدولة الفرنسية التي تديرها وكاله البحوث الوطنية في اطار برنامج “إينفيستيسيمينتس d’avenir (الاستثمارات من أجل المستقبل)” مع الاشاره ANR-10-اياهو-03 (عدوي البحر المتوسط) وبواسطة ريوجيون بروفانس الألب كوت دازور والتمويل الأوروبي FEDER PRIMI.
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
- Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
- Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
- Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033 (2003).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
- Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
- Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).
- Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).
- Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300 (2016).
- Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372 (2018).
- Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
- Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
- Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76 (2016).
- Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
- Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).
- Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
- Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278 (2016).
- Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).
- Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
- Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
- Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235 (2018).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
- Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).
- Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).
- Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
- Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
- Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).
- Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).
- Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).
