Enkelt celle mikro-aspiration som en alternativ strategi for fluorescens-aktiverede celle sortering for Giant virus blanding adskillelse
Summary
Her beskriver vi en enkelt celle mikro-aspiration metode til adskillelse af inficerede amoebae. For at adskille virale subpopulationer i Vermamoeba vermiformis inficeret af Faustovira og ukendte gigantiske vira, vi udviklede protokollen nedenfor og viste sin evne til at adskille to lav-overflod roman Giant vira.
Abstract
Under amøbe-samkulturprocessen kan mere end én virus isoleres i en enkelt brønd. Vi har tidligere løst dette problem ved slutpunkts fortynding og/eller fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) anvendt på den virale population. Men, når virus i blandingen har lignende morfologiske egenskaber og en af de vira multiplicerer langsomt, tilstedeværelsen af to vira opdages på stadiet af genom samling og vira kan ikke adskilles for yderligere karakterisering. For at løse dette problem, vi udviklet en enkelt celle mikro-aspiration procedure, der giver mulighed for adskillelse og kloning af meget lignende vira. I det nuværende arbejde præsenterer vi, hvordan denne alternative strategi tillod os at adskille de små virale subpopulationer af Clandestinovirus ST1 og Usurpativirus LCD7, gigantiske vira, der vokser langsomt og ikke fører til amoebal lysis i forhold til den lytiske og hurtigtvoksende Faustovirus. Renheds kontrol blev vurderet ved specifik genforstærkning, og der blev fremstillet vira til yderligere karakterisering.
Introduction
Nukleocytoplasmic store DNA-vira (ncldv) er yderst forskelligartede, defineret af fire familier, der inficerer eukaryoter1. De første beskrevne vira med genomer over 300 KBP var Phydcodnaviridae, herunder paramecium Bursaria chlorella virus 1 PBCV12. Isolationen og den første beskrivelse af Mimivirus, viste, at størrelsen af vira fordoblet i forhold til både størrelsen af partiklen (450 nm) og længden af genomet (1,2 MB)3. Siden da, mange gigantiske vira er blevet beskrevet, normalt isoleret ved hjælp af en amøbe Co-kultur procedure. Flere gigantiske vira med forskellige morfologier og genetisk indhold kan isoleres fra Acanthamoeba Sp. celler, herunder Marseillevira, Pandoraviruser, Pithovira, Mollivirus, Cedratvira, Pacmanvirus, tupanvirus, og for nylig Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallelt hermed tillod isoleringen af vermamoeba vermiformen isolation og beskrivelse af de gigantiske vira faustovirus, kaumoebavirus og orpheovirus18,19,20. Andre gigantiske vira blev isoleret med deres vært protists, såsom cafeteria roenbergensis21, aureococcus anophagefferens22, chrysochromulina ericina23, og Bodo saltans 24. Alle disse isoleringer var resultatet af et stigende antal hold, der arbejder på isolation, og indførelsen af strategi opdateringer med høj dataoverførselshastighed25,26,27,28, såsom forbedring af co-kultur systemet med anvendelse af strømnings cytometri.
I 2016 brugte vi en strategi, der knytter Co-Culture og flow flowcytometri til at isolere gigantiske vira27. Denne strategi blev udviklet for at øge antallet af prøver inokuleret, at sprede protister anvendes som celle understøtninger, og til hurtigt at detektere lysis af celle støtte. Systemet blev opdateret ved at tilføje et supplerende trin for at undgå foreløbig molekylær biologi identifikation og hurtig påvisning af en ukendt viral population som i tilfælde af Pacmanvirus29. Koblings flow cytometri til celle sortering tilladt til adskillelse af en blanding af Mimivirus og Cedratvirus A1130. Men vi stødte senere på begrænsningerne ved adskillelse og påvisning af disse virale delpopulationer ved flow cytometri. Efter sekvensering, da vi samlet genomer af Faustovirus ST125 og FAUSTOVIRUS LCD7 (ikke offentliggjorte data), vi overraskende fundet i hver forsamling to supplerende genomer af to nye vira ikke er identificeret i offentlige genomdata baser. Imidlertid viste hverken strømnings cytometri eller transmissions elektronisk mikroskopi (TEM), at amoebaerne var inficeret med to forskellige vira, Clandestinovirus ST1 og Usurpativirus LCD7. Vi designede specifikke PCR-systemer til at forstærke Faustovirus, Usurpativirus og Clandestinovirus markører baseret på deres genomer; vores formål var at have PCR-baserede systemer, der muliggør verifikation af renheden af de vira, der adskilles. Men, end-punkt fortynding og flow cytometri undladt at adskille dem. Isolationen af denne enkelt virale befolkning var vanskelig, fordi hverken morfologien eller replikerende elementer af Clandestinovirus og Usurpativirus populationer er blevet karakteriseret. Vi opdagede kun én viral population ved flow cytometri på grund af overlapning af de to populationer (testet efter den effektive adskillelse). Vi forsøgte at adskille dem ved hjælp af en enkelt partikel sortering på 96-brønd plader, men vi observerer ikke nogen cytopatiske effekter, og vi opdagede hverken Clandestinovirus eller Usurpativirus ved PCR amplifikation. Endelig var det kun kombinationen af slutpunkt fortynding efterfulgt af enkelt amøbe mikro-aspiration, der gjorde det muligt adskillelse af disse to low-overflod Giant vira fra faustovira. Denne metode til adskillelse er genstand for denne artikel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varigheden af enkelt cellens mikroaspirations håndtering og dens gode funktion er operatør afhængig. De forskellige trin i forsøget kræver præcision. Brugen af micromanipulation komponenter af arbejdsstationen skal være under konstant kontrol ved at observere processen med mikro-aspiration og frigivelse af cellen. Opfølgningen ved mikroskopisk observation er nødvendig for opsamling og overførsel af en celle. En erfaren operatør kan tage 1 til 2 timer at isolere 10 celler og genover føre dem en efter en afhæn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke både Jean-Pierre Baudoin og Olivier Mbarek for deres råd og Claire Andréani for hendes hjælp i engelske rettelser og modifikationer. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra den franske stat, der forvaltes af det nationale forskningsagentur under programmet “Investissements d’avenir (investeringer for fremtiden)” med referencen ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée-infektion) og af Région Provence Alpes Côte d’Azur og europæisk finansiering af FEDER PRIMI.
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
- Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
- Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
- Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033 (2003).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
- Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
- Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).
- Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).
- Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300 (2016).
- Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372 (2018).
- Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
- Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
- Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76 (2016).
- Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
- Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).
- Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
- Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278 (2016).
- Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).
- Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
- Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
- Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235 (2018).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
- Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).
- Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).
- Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
- Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
- Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).
- Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).
- Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).
