Micro-aspiration à cellule unique comme stratégie alternative au tri cellulaire activé par fluorescence pour la séparation du mélange de virus géants
Summary
Ici, nous décrivons une méthode de micro-aspiration de cellules simples pour la séparation des amibes infectées. Afin de séparer les sous-populations virales de Vermamoeba vermiformis infectés par des Faustovirus et des virus géants inconnus, nous avons développé le protocole détaillé ci-dessous et démontré sa capacité à séparer deux nouveaux virus géants à faible abondance.
Abstract
Pendant le processus de co-culture de l’amibe, plus d’un virus peut être isolé dans un seul puits. Nous avons précédemment résolu ce problème par dilution de point final et/ou tri activé de cellules de fluorescence (FACS) appliqué à la population virale. Cependant, lorsque les virus dans le mélange ont des propriétés morphologiques similaires et que l’un des virus se multiplie lentement, la présence de deux virus est découverte au stade de l’assemblage du génome et les virus ne peuvent pas être séparés pour une autre caractérisation. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une procédure de micro-aspiration à cellule unique qui permet la séparation et le clonage de virus très similaires. Dans le présent travail, nous présentons comment cette stratégie alternative nous a permis de séparer les petites sous-populations virales de Clandestinovirus ST1 et Usurpativirus LCD7, virus géants qui se développent lentement et ne conduisent pas à la lyse amiale par rapport à la lytique et à croissance rapide Le Faustovirus. Le contrôle de pureté a été évalué par amplification spécifique de gène et des virus ont été produits pour davantage de caractérisation.
Introduction
Les virus nucléocytoplasmiques de gros virus d’ADN (NCLDV) sont extrêmement divers, définis par quatre familles qui infectent des eucaryotes1. Les premiers virus décrits avec des génomes supérieurs à 300 kbp étaient Phydcodnaviridae, y compris Paramecium bursaria Chlorella virus 1 PBCV12. L’isolement et la première description de Mimivirus, a montré que la taille des virus a doublé en termes à la fois de la taille de la particule (450 nm) et la longueur du génome (1,2 Mo)3. Depuis lors, de nombreux virus géants ont été décrits, généralement isolés à l’aide d’une procédure de co-culture de l’amibe. Plusieurs virus géants avec des morphologies et des contenus génétiques différents peuvent être isolés à partir des cellules acanthamoeba sp., y compris les virus de Marseille, Pandoravirus, Pithovirus, Mollivirus, Cedratvirus, Pacmanvirus, Tupanvirus, et récemment Médusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. En parallèle, l’isolement de Vermamoeba vermiformis a permis l’isolement et la description des virus géants Faustovirus, Kaumoebavirus, et Orpheovirus18,19,20. D’autres virus géants ont été isolés avec leurs protistes hôtes, tels que la cafétéria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23, et Bodo saltans 24. Tous ces isolements sont le résultat d’un nombre croissant d’équipes travaillant sur l’isolement et de l’introduction de mises à jour de stratégie à haut débit25,26,27,28, telles que le l’amélioration du système de co-culture avec l’utilisation de la cytométrie de flux.
En 2016, nous avons utilisé une stratégie associant la co-culture et la cytométrie des flux pour isoler les virus géants27. Cette stratégie a été développée pour augmenter le nombre d’échantillons inoculés, pour diversifier les protistes utilisés comme supports cellulaires, et pour détecter rapidement la lyse du support cellulaire. Le système a été mis à jour en ajoutant une étape supplémentaire pour éviter l’identification préliminaire de la biologie moléculaire et la détection rapide d’une population virale inconnue comme dans le cas de Pacmanvirus29. La cytométrie de flux de couplage au tri cellulaire a permis la séparation d’un mélange de Mimivirus et cedratvirus A1130. Cependant, nous avons plus tard rencontré les limites de la séparation et de la détection de ces sous-populations virales par cytométrie de flux. Après le séquençage, lorsque nous avons assemblé les génomes du Faustovirus ST125 et du Faustovirus LCD7 (données non publiées), nous avons étonnamment trouvé dans chaque assemblage deux génomes supplémentaires de deux nouveaux virus non identifiés dans les bases de données du génome public. Cependant, ni la cytométrie de flux ni la microscopie électronique de transmission (TEM) n’ont montré que les amibes étaient infectées par deux virus différents, le clandestinovirus ST1 et l’usurpativirus LCD7. Nous avons conçu des systèmes PCR spécifiques pour amplifier les marqueurs de Faustovirus, d’Usurpativirus et de Clandestinovirus respectivement en fonction de leurs génomes ; notre but était d’avoir des systèmes basés sur PCR qui permettent de vérifier la pureté des virus séparés. Cependant, la dilution et la cytométrie de flux de point final n’ont pas réussi à les séparer. L’isolement de cette population virale unique a été difficile parce que ni la morphologie ni les éléments réplicateurs des populations de clandestinovirus et d’usurpativirus n’ont été caractérisés. Nous avons détecté une seule population virale par cytométrie de flux due au chevauchement des deux populations (testéeaprès la séparation effective). Nous avons essayé de les séparer à l’aide d’un seul tri de particules sur des plaques de 96 puits, mais nous n’avons observé aucun effet cytopathique, et nous n’avons détecté ni clandestinovirus ni usurpativirus par amplification PCR. Enfin, ce n’est que la combinaison de la dilution des points de terminaison suivie d’une seule micro-aspiration à l’amibe qui a permis la séparation de ces deux virus géants à faible abondance des Faustovirus. Cette méthode de séparation fait l’objet de cet article.
Protocol
Representative Results
Discussion
La durée de la manipulation de micro-aspiration à cellule unique et son bon fonctionnement dépendent de l’opérateur. Les différentes étapes de l’expérience exigent de la précision. L’utilisation des composants de micromanipulation du poste de travail doit être sous contrôle constant en observant le processus de micro-aspiration et la libération de la cellule. Le suivi par observation microscopique est nécessaire pour la capture et le transfert d’une cellule. Un opérateur expérimenté peut prendre 1 à 2 h p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier à la fois Jean-Pierre Baudoin et Olivier Mbarek pour leurs conseils et Claire Andréani pour son aide dans les corrections et les modifications en anglais. Ce travail a été soutenu par une subvention de l’Etat Français gérée par l’Agence Nationale de la Recherche dans le cadre du programme “Investissements d’avenir)” avec la référence ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée Infection) et par Région Provence Alpes Côte d’Azur et financement européen FEDER PRIMI.
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
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