Single Cell Micro-aspirasjon som en alternativ strategi for å fluorescens-aktivert Cell sortering for Giant virus blanding separasjon
Summary
Her beskriver vi en enkelt celle mikro-aspirasjon metode for separasjon av infiserte amøber. For å skille viral subpopulasjoner i Vermamoeba vermiformis smittet av Faustoviruses og ukjente gigantiske virus, utviklet vi protokollen detaljert nedenfor og demonstrerte sin evne til å skille to lav-overflod romanen gigantiske virus.
Abstract
Under Amoeba co-kultur prosessen, mer enn ett virus kan være isolert i en enkelt brønn. Vi har tidligere løst dette problemet ved sluttpunkt fortynning og/eller fluorescens aktivert celle sortering (FACS) brukes til viral befolkningen. Men når virus i blandingen har lignende morfologiske egenskaper og en av virusene multipliserer langsomt, er tilstedeværelsen av to virus oppdaget på scenen av Genova montering og virus kan ikke skilles for videre karakterisering. For å løse dette problemet, utviklet vi en enkelt celle mikro-aspirasjon prosedyre som gjør det mulig for separasjon og kloning av svært like virus. I dagens arbeid, presenterer vi hvordan denne alternative strategien tillot oss å skille de små viral subpopulasjoner av Clandestinovirus ST1 og Usurpativirus LCD7, gigantiske virus som vokser langsomt og ikke fører til amoebal lyse i forhold til lytisk og raskt voksende Faustovirus. Renhet kontroll ble vurdert av spesifikke gen forsterkning og virus ble produsert for videre karakterisering.
Introduction
Nucleocytoplasmic store DNA virus (NCLDV) er svært mangfoldig, definert av fire familier som infisere Landplantenes1. Det for det første beskrevet viruser med genomer over 300 KBP var Phydcodnaviridae, inkluderer amøbehjerne bursaria chlorella virus 1 PBCV12. Isolasjonen og den første beskrivelsen av Mimivirus, viste at størrelsen på viruset doblet i forhold til både størrelsen på partikkel (450 nm) og lengden på Genova (1,2 MB)3. Siden da har mange gigantiske virus blitt beskrevet, vanligvis isolert ved hjelp av en Amoeba co-kultur prosedyre. Adskillige giganten viruser med annerledes morfologier og genetisk innholdet kan isolere fra Acanthamoeba Sp. celler, inkluderer Marseilleviruses, Pandoraviruses, Pithoviruses, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, Tupanvirus, og i den seneste tid Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallelt var isolasjonen av Vermamoeba vermiformis tillatt isolasjonen og beskrivelsen av de gigantiske virusene Faustovirus, Kaumoebavirus og Orpheovirus18,19,20. Andre gigantiske virus ble isolert med verts protister, som kafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23og Bodø saltans 24. Alle disse isolasjoner var resultatet av et økende antall lag som jobbet med isolasjon og innføringen av strategi oppdateringer med høy gjennomstrømming25,26,27,28, slik som forbedring av co-kulturen systemet med bruk av Flow flowcytometri.
I 2016, vi brukte en strategi knytte co-kultur og flyt flowcytometri å isolere gigantiske virus27. Denne strategien ble utviklet for å øke antall prøver inokulert, å diversifisere protister brukt som celle støtter, og for raskt å oppdage lyse av cellen støtte. Systemet ble oppdatert ved å legge til et supplerende skritt for å unngå foreløpige molekylærbiologi identifisering og rask påvisning av en ukjent viral befolkning som i tilfelle av Pacmanvirus29. Koblings flyt flowcytometri til celle sortering som er tillatt ved separasjon av en blanding av Mimivirus og Cedratvirus A1130. Men vi senere møtte begrensningene av separasjon og påvisning av disse viral subpopulasjoner ved flyt flowcytometri. Etter sekvensering, når vi samlet genomer av Faustovirus ST125 og Faustovirus LCD7 (upubliserte data), vi overraskende funnet i hver forsamling to supplerende genomer av to romanen virus ikke identifisert i offentlige Genova databaser. Imidlertid viste verken flyt flowcytometri eller overføring av elektroniske mikroskopi (TEM) at amoebaes ble infisert av to forskjellige virus, Clandestinovirus ST1 og Usurpativirus LCD7. Vi utformet spesifikke PCR-systemer for å forsterke Faustovirus, Usurpativirus, og Clandestinovirus markører henholdsvis basert på deres genomer; vårt formål var å ha PCR-baserte systemer som muliggjør verifisering av renheten av virusene blir separert. Imidlertid klarte ikke ende punkts fortynning og strømnings flowcytometri å skille dem. Isolasjonen av denne ene viral befolkningen var vanskelig fordi verken morfologi eller replicative elementer av Clandestinovirus og Usurpativirus befolkninger har blitt karakterisert. Vi oppdaget bare en viral befolkning av flyte flowcytometri på grunn av det overlappe av det to befolkninger (testet etter det effektiv atskillelse). Vi prøvde å skille dem ved hjelp av én partikkel sortering på 96-brønn plater, men vi observerte ingen Cytopathic effekter, og vi oppdaget verken Clandestinovirus eller Usurpativirus av PCR-forsterkning. Til slutt var det bare kombinasjonen av endepunktet fortynning etterfulgt av singel Amoeba mikro-aspirasjon som aktiverte separasjon av disse to lav-overflod gigantiske virus fra Faustoviruses. Denne metoden for separasjon er gjenstand for denne artikkelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varigheten av enkelt celle mikro-aspirasjon håndtering og god funksjon er operatøravhengig. De ulike trinnene i eksperimentet krever presisjon. Bruken av de mikromanipulering komponentene i arbeidsstasjonen må være under konstant kontroll ved å observere prosessen med mikro-aspirasjon og utgivelsen av cellen. Oppfølgingen av mikroskopisk observasjon er nødvendig for fangst og overføring av en celle. En erfaren operatør kan ta 1 til 2 t for å isolere 10 celler og skrivermodeller dem en etter en, avhengig av over…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke både Jean-Pierre Baudoin og Olivier Mbarek for deres råd og Claire Andréani for hennes hjelp på engelsk rettelser og modifikasjoner. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra den franske staten forvaltes av National Research Agency under “Investissements d’avenir (investeringer for fremtiden)” program med referanse ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée infeksjon) og ved Région Provence Alpes Côte d’Azur og europeisk finansiering FEDER PRIMI.
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
- Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
- Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
- Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033 (2003).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
- Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
- Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).
- Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).
- Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300 (2016).
- Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372 (2018).
- Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
- Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
- Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76 (2016).
- Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
- Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).
- Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
- Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278 (2016).
- Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).
- Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
- Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
- Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235 (2018).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
- Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).
- Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).
- Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
- Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
- Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).
- Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).
- Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).
