Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante

Summary

Aqui, descrevemos um método de micro-aspiração de célula única para a separação de amebae infectada. A fim separar subpopulações virais no vermiformis de Vermamoeba contaminado por Faustoviruses e por vírus gigantes desconhecidos, nós desenvolvemos o protocolo detalhado abaixo e demonstramos sua habilidade de separar dois vírus gigantes novos low-abundance.

Abstract

Durante o processo de cocultura de ameba, mais de um vírus pode ser isolado em um único poço. Previamente resolvemos esse problema por diluição final e/ou fluorescência ativada de classificação celular (FACS) aplicada à população viral. No entanto, quando os vírus na mistura têm propriedades morfológicas semelhantes e um dos vírus se multiplica lentamente, a presença de dois vírus é descoberta na fase de montagem do genoma e os vírus não podem ser separados para maior caracterização. Para resolver este problema, desenvolvemos um procedimento de micro-aspiração de célula única que permite a separação e clonagem de vírus altamente semelhantes. No presente trabalho, apresentamos como essa estratégia alternativa nos permitiu separar as pequenas subpopulações virais de Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7, vírus gigantes que crescem lentamente e não levam à lúse amebal em comparação com o lytic e o rápido crescimento Faustovírus. O controle da pureza foi avaliado pela amplificação específica do gene e os vírus foram produzidos para uma caracterização mais adicional.

Introduction

Os vírus nucleocitoplasmic do ADN grande (NCLDV) são extremamente diversos, definidos por quatro famílias que infectam eucariontes^1. Os primeiros vírus descritos com genomas acima de 300 kbp foram Phydcodnaviridae,incluindo paramecium bursaria chlorella vírus 1 PBCV1². O isolamento e a primeira descrição do Mimivirus mostraram que o tamanho dos vírus dobrou em termos do tamanho da partícula (450 nm) quanto do comprimento do genoma (1,2 Mb)³. Desde então, muitos vírus gigantes foram descritos, geralmente isolados usando um procedimento de cocultura de ameba. Vários vírus gigantes com diferentes morfologias e conteúdos genéticos podem ser isolados das células acanthamoeba sp., incluindo Marseilleviruses, Pandoraviruses, Pithoviruses, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, Tupanvirus e recentemente Medusavirus^{4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17.} Paralelamente, o isolamento de Vermamoeba vermiformis permitiu o isolamento e descrição dos vírus gigantes Faustovirus, Kaumoebavirus e Orpheovirus^18,19,20. Outros vírus gigantes foram isolados com seus protistas hospedeiros, como cafeteria roenbergensis^21, Aureococcus anophagefferens²², Chrysochromulina ericina^23,e bodo saltans ^24. Todos esses isolamentos foram o resultado de um número crescente de equipes trabalhando no isolamento e na introdução de atualizações de estratégia de alta de supressão^25,26,27,28,como a melhoria do sistema de co-cultura com o uso de citometria de fluxo.

Em 2016, usamos uma estratégia associando cocultura e citometria de fluxo para isolar vírus gigantes^27. Esta estratégia foi desenvolvida para aumentar o número de amostras inoculadas, para diversificar os protistas usados como suportes celulares e detectar rapidamente a lise do suporte celular. O sistema foi atualizado adicionando um passo suplementar para evitar a identificação preliminar da biologia molecular e detecção rápida de uma população viral desconhecida como no caso do Pacmanvirus²⁹. Acoplamento citometria fluxo para classificação celular permitido para a separação de uma mistura de Mimivirus e Cedratvirus A11³⁰. No entanto, mais tarde encontramos as limitações da separação e detecção dessas subpopulações virais por citometria de fluxo. Após o sequenciamento, quando montamos os genomas do Faustovirus ST1²⁵ e Faustovirus LCD7 (dados inéditos), surpreendentemente encontramos em cada montagem dois genomas suplementares de dois novos vírus não identificados em bancos de dados do genoma público. No entanto, nem a citometria de fluxo nem a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) mostraram que as amebaes foram infectadas por dois vírus diferentes, Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7. Nós projetamos sistemas específicos de PCR para amplificar os marcadores faustovírus, usurpativírus e clandestinovírus, respectivamente, com base em seus genomas; nosso objetivo era ter sistemas baseados em PCR que permitissem a verificação da pureza dos vírus que estão sendo separados. No entanto, a diluição do ponto final e a citometria de fluxo não conseguiram separá-los. O isolamento dessa única população viral foi difícil porque nem a morfologia nem os elementos replicativos das populações de Clandestinovírus e Usurpativírus têm sido caracterizados. Detectamos apenas uma população viral por citometria de fluxo devido à sobreposição das duas populações (testadas após a separação efetiva). Tentamos separá-los usando uma única classificação de partículas em placas de 96 poços, mas não observamos quaisquer efeitos citopáticos, e não detectamos nem Clandestinovirus nem Usurpativirus por amplificação pcr. Finalmente, foi apenas a combinação de diluição do ponto final seguido por micro-aspiração única ameba que permitiu a separação desses dois vírus gigantes de baixa abundância de faustovírus. Este método de separação é o objeto deste artigo.

Protocol

1. Cultura ameba Use vermiformis de Vermamoeba (tensão CDC19) como uma sustentação da pilha. Adicione 30 mL de protease-peptone-levedura extrato-glicose médio (PYG) (Tabela 1) e 3 mL da amebae em uma concentração de 1 x 106 células / mL em um frasco de cultura de 75 cm2 células. Mantenha a cultura a 28 °C. Após 48 h, quantificar a amebae usando lâminas de contagem. Para enxaguar, colher as células a uma concentra…

Representative Results

A micro-aspiração de célulaúnica é um processo de micromanipulação otimizado neste manuscrito (Figura 1). Esta técnica permite a captura de uma ameba arredondada e infectada (Figura 2A)e seu lançamento em uma placa nova contendo amebae não infectada (Figura 2). É um protótipo funcional que se aplica ao sistema de co-cultura e isolou com sucesso vírus gigantes não líticos. Esta abordagem foi usada pela…

Discussion

A duração do manuseio de micro-aspiração de célula única e seu bom funcionamento é dependente do operador. As diferentes etapas do experimento requerem precisão. O uso dos componentes de micromanipulação da estação de trabalho deve estar controle constante observando o processo de micro-aspiração e a liberação da célula. O acompanhamento por observação microscópica é necessário para captura e transferência de uma célula. Um operador experiente pode levar de 1 a 2 h para isolar 10 células e retran…

Materials

Agarose Standard	Euromedex	Unkown	Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix	Applied Biosystems	4398876	Standard PCR
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Control the cells during the microaspiration process
Corning cell culture flasks 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Culture
Corning cell culture flasks 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	Culture
Corning cell culture flasks 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	Culture
DFC 425C camera	LEICA	Unkown	Observation/Monitoring
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	Observation/Monitoring
EZ1 advanced XL	Quiagen	9001874	DNA extraction
Glasstic Slide 10 With Counting Grids	Kova International	87144E	Cell count
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	Standard PCR
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiration and release of cells
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Microcapillary positioning
Nuclease-Free Water	ThermoFischer	AM9920	Standard PCR
Optima XPN Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A94469	Virus purification
Petri dish 35 mm	Ibidi	81158	Culture/observation
Sterile syringe filters 5 µm	Sigma-aldrich	SLSV025LS	Filtration
SYBR green Type I	Invitrogen	unknown	Fluorescent molecular probes/ flow cytometry
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Standard PCR; DNA gel stain
Tecnai G20	FEI	Unkown	Electron microscopy
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	BECKMAN COULTER	337922	Virus purification
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm	BECKMAN COULTER	344058	Virus purification