Single cell Micro-aspiration som en alternativ strategi för fluorescens-aktiverad cell sortering för Giant virus blandning separation
Summary
Här beskriver vi en enda cell mikro-aspiration metod för separation av infekterade amoebae. För att separera viral subpopulationer i Vermamoeba vermiformis smittade av faustoviruses och okända jätte virus, utvecklade vi protokollet som beskrivs nedan och visat sin förmåga att separera två låg-överflöd roman Giant virus.
Abstract
Under amoeba Co-Culture processen, mer än ett virus kan isoleras i en enda brunn. Vi löste tidigare denna fråga genom slutpunkt utspädning och/eller fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) tillämpas på virus populationen. Men när virusen i blandningen har liknande morfologiska egenskaper och ett av virusen multiplicerar långsamt, upptäcks närvaron av två virus i stadiet av arvsmassan och virusen kan inte separeras för ytterligare karakterisering. För att lösa detta problem, utvecklade vi en enda cell mikro-aspiration förfarande som möjliggör separation och kloning av mycket likartade virus. I det nuvarande arbetet presenterar vi hur denna alternativa strategi tillät oss att separera de små viral subpopulationer av Clandestinovirus ST1 och Usurpativirus LCD7, jätte virus som växer långsamt och inte leder till amoebal Lys jämfört med den lytiska och snabbväxande Faustovirus. Renhetskontroll bedömdes genom specifik genamplifiering och virus producerades för ytterligare karakterisering.
Introduction
Nukleocytoplasmic stora DNA-virus (ncldv) är extremt varierande, definieras av fyra familjer som infekterar Eukaryoter1. De första beskrivna virusen med genom över 300 KBP var Phydcodnaviridae, inklusive paramecium Bursaria Chlorella virus 1 PBCV12. Isoleringen och den första beskrivningen av Mimivirus visade att virusets storlek fördubblades både när det gäller partikelstorlek (450 nm) och genomets längd (1,2 MB)3. Sedan dess har många gigantiska virus beskrivits, vanligtvis isolerade med hjälp av en amoeba Co-Culture förfarande. Flera gigantiska virus med olika morfologier och genetiska innehåll kan isoleras från Acanthamoeba SP. celler, inklusive Marseilleviruses, Pandoraviruses, Pithovirusen, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, tupanvirus, och nyligen Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallellt, isolering av vermamoeba vermiformis tillåts isolering och beskrivning av jätten virus faustovirus, kaumoebavirus, och orpheovirus18,19,20. Andra gigantiska virus isolerades med sina värdprotister, såsom cafeteria roenbergensis21, aureococcus ansiefferens22, chrysochromulina patentifolium23och Bodo saltans 24. Alla dessa isoleringar var resultatet av ett ökande antal team som arbetar på isolering och införandet av hög genomströmning strategi uppdateringar25,26,27,28, såsom förbättring av co-Culture-systemet med hjälp av flödescytometri.
I 2016, vi använde en strategi som associerar Co-kultur och flödescytometri att isolera Giant virus27. Denna strategi utvecklades för att öka antalet prover inokulerade, att diversifiera protister som används som cell stöd, och att snabbt upptäcka lys av cell stöd. Systemet uppdaterades genom att lägga till ett kompletterande steg för att undvika preliminär molekylär biologi identifiering och snabb upptäckt av en okänd virus population som i fallet med Pacmanvirus29. Kopplingflödescytometri till cell sortering tillåten för separation av en blandning av Mimivirus och Cedratvirus A1130. Emellertid, vi stötte senare begränsningarna av separation och detektion av dessa virala subpopulationer av flödescytometri. Efter sekvensering, när vi monterade genomen av Faustovirus ST125 och FAUSTOVIRUS LCD7 (opublicerade data), Vi hittade förvånansvärt i varje församling två kompletterande genom av två nya virus som inte identifierats i offentliga Genome databaser. Men varken flödescytometri eller transmission elektronisk mikroskopi (TEM) visade att amoebaes var smittade av två olika virus, Clandestinovirus ST1 och Usurpativirus LCD7. Vi har utformat specifika PCR-system för att förstärka markörer för Faustovirus, Usurpativirus och Clandestinovirus baserat på deras genom. vårt syfte var att ha PCR-baserade system som möjliggör verifiering av renheten hos de virus som separeras. Slutpunkts utspädning och flödescytometri kunde dock inte separera dem. Isoleringen av denna enda viral population var svår eftersom varken morfologin eller replikativa element av Clandestinovirus och Usurpativirus populationer har karakteriserats. Vi upptäckte endast en virus population genom flödescytometri på grund av överlappningen mellan de två populationerna (testad efter den effektiva separationen). Vi försökte separera dem med enkel partikel sortering på 96-bra tallrikar, men vi har inte observerat några cytopatiska effekter, och vi upptäckte varken Clandestinovirus eller Usurpativirus av PCR Amplification. Slutligen var det bara kombinationen av slutpunkt utspädning följt av en enda amoeba mikro-aspiration som möjliggjorde separation av dessa två låg-överflöd jätte virus från Faustoviruses. Denna separationsmetod är föremålet för denna artikel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varaktigheten av Single cell Micro-aspiration hantering och dess goda funktion är operatör-beroende. De olika stegen i experimentet kräver precision. Användningen av mikromanipuleringskomponenterna i arbetsstationen måste vara under ständig kontroll genom att observera processen för mikroaspiration och frisläppandet av cellen. Uppföljningen av mikroskopisk observation är nödvändig för avskiljning och överföring av en cell. En erfaren operatör kan ta 1 till 2 h för att isolera 10 celler och återöverför…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka både Jean-Pierre Baudoin och Olivier Mbarek för deras råd och Claire Andréani för hennes hjälp på engelska rättelser och modifieringar. Detta arbete stöddes av ett bidrag från den franska staten som förvaltas av den nationella forsknings byrån under “Investissements d’ Avenir (investeringar för framtiden)” program med referensen ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée infektion) och av Région Provence Alpes Côte d’Azur och EU-finansiering FEDER PRIMI.
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
- Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
- Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
- Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033 (2003).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
- Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
- Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).
- Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).
- Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300 (2016).
- Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372 (2018).
- Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
- Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
- Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76 (2016).
- Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
- Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).
- Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
- Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278 (2016).
- Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).
- Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
- Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
- Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235 (2018).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
- Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).
- Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).
- Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
- Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
- Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).
- Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).
- Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).
