Dev Virüs Karışım Ayırma için Floresan-Aktive Hücre Sıralama alternatif bir strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon
Summary
Burada, enfekte amiplerin ayrılması için tek bir hücreli mikro-aspirasyon yöntemini tanımlıyoruz. Faustovirüsler ve bilinmeyen dev virüsler tarafından enfekte Vermamoeba vermiformis viral alt popülasyonları ayırmak için, aşağıda ayrıntılı protokolü geliştirdi ve iki düşük bolluk yeni dev virüs ayırma yeteneğini gösterdi.
Abstract
Amip ortak kültür süreci sırasında, birden fazla virüs tek bir kuyuda izole edilebilir. Daha önce bu sorunu, viral popülasyona uygulanan son nokta seyreltme ve/veya floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile çözmüştük. Ancak, karışımdaki virüsler benzer morfolojik özelliklere sahip olduğunda ve virüslerden biri yavaş yavaş çoğaldığında, genom montaj aşamasında iki virüsün varlığı keşfedilir ve virüsler daha fazla karakterizasyon için ayrılamaz. Bu sorunu çözmek için, son derece benzer virüslerin ayrılması ve klonlanmasına olanak tanıyan tek bir hücreli mikro aspirasyon prosedürü geliştirdik. Bu çalışmada, bu alternatif strateji bize Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7, yavaş büyüyen ve amipli ve hızlı büyüyen göre amip lisis yol açmaz dev virüslerin küçük viral alt popülasyonları ayırmak için izin nasıl sayılmızı sıyoruz Faustovirüs. Saflık kontrolü spesifik gen amplifikasyonu ile değerlendirildi ve daha fazla karakterizasyon için virüsler üretildi.
Introduction
Nükleozositoplazmik büyük DNA virüsleri (NCLDV) ökaryotlara bulaşandört aile tarafından tanımlanan son derece çeşitlidir. 300 kbp üzerinde genomları ile ilk açıklanan virüsler Phydcodnaviridaeedildi , Paramecium bursaria Chlorella virüsü dahil 1 PBCV12. İzolasyon ve Mimivirüs ilk açıklaması, virüslerin boyutu parçacık (450 nm) ve genom uzunluğu (1.2 Mb)3hem boyutu açısından iki katına gösterdi . O zamandan beri, birçok dev virüs, genellikle bir amip co-kültür prosedürü kullanılarak izole tarif edilmiştir. Farklı morfolojileri ve genetik içeriği ile birçok dev virüs Marsilyavirüsler, Pandoravirüsler, Pithoviruses, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, Tupanvirus ve son zamanlarda dahil olmak üzere Acanthamoeba sp. hücreleri, izole edilebilir Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Buna paralel olarak, Vermamoeba vermiformis izolasyon izolasyon ve dev virüsler Faustovirus, Kaumoebavirus ve Orpheovirus18, 19,20açıklamasına izin verdi. Diğer dev virüsler kafeterya roenbergensis21gibi ev sahibi protistler ile izole edildi, Aureococcus anoofagefferens22, Chrysochromulina ericina23, ve Bodo saltans 24. yıl. Tüm bu izolasyonlar izolasyon ve yüksek iş-iş stratejisi güncellemeleri25,26,27,28,gibi giriş üzerinde çalışan ekiplerin artan sayıda sonucu akış sitometrisi kullanımı ile ortak kültür sisteminin iyileştirilmesi.
2016 yılında, dev virüsleri izole etmek için ortak kültür ve akış sitometrisini ilişkilendiren bir strateji kullandık27. Bu strateji aşılanan numune sayısını artırmak, hücre desteği olarak kullanılan protistleri çeşitlendirmek ve hücre desteğinin düzgünliğini hızlı bir şekilde tespit etmek için geliştirilmiştir. Sistem pacmanvirus29durumunda olduğu gibi ön moleküler biyoloji kimlik ve bilinmeyen bir viral popülasyonun hızlı tespiti önlemek için ek bir adım ekleyerek güncellendi . Mimivirüs ve Cedratvirus A1130karışımının ayrılmasıiçin izin verilen hücre ayrıştırma için kaplin akış sitometri . Ancak daha sonra bu viral alt popülasyonların akış sitometrisi ile ayrılması ve saptanması ile ilgili sınırlamalarla karşılaştık. Sıralamadan sonra, Faustovirus ST125 ve Faustovirus LCD7 (yayınlanmamış veriler) genomlarını bir araya getirdiğimizde, şaşırtıcı bir şekilde her derlemede, kamu genom veritabanlarında tanımlanmamış iki yeni virüsün iki ek genomunu bulduk. Ancak, ne akış sitometrisi ne de iletim elektronik mikroskopi (TEM) amiplerin iki farklı virüs, Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7 ile enfekte olduğunu gösterdi. Faustovirüs, Usurpativirus ve Clandestinovirus belirteçlerini sırasıyla genomlarına göre güçlendirmek için özel PCR sistemleri tasarladık; amacımız, ayrılan virüslerin saflıklarının doğrulanmasını sağlayan PCR tabanlı sistemlere sahip olmaktı. Ancak, son nokta seyreltme ve akış sitometri onları ayırmak için başarısız oldu. Clandestinovirus ve Usurpativirus popülasyonlarının ne morfolojisi ne de çoğaltıcı elementleri karakterize edilmediği için bu tek viral popülasyonun izole edilmesi zordu. İki popülasyonun üst üste binme (etkili ayrışma sonrasında test edildiği) nedeniyle akış sitometrisi ile sadece bir viral popülasyon tespit ettik. 96 kuyulu plakalarda tek partikül ayrıştırma kullanarak ayırmaya çalıştık, ancak herhangi bir sitopatik etki gözlemlemedik ve PCR amplifikasyon uğramı ile ne Clandestinovirus ne de Usurpativirus tespit ettik. Son olarak, faustovirüsler bu iki düşük bolluk dev virüslerin ayrılmasını etkin tek amip mikro-aspirasyon izledi sadece uç nokta seyreltme kombinasyonu oldu. Bu ayırma yöntemi bu makalenin nesnesidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tek hücreli mikro-aspirasyon işleme süresi ve iyi çalışması operatöre bağlıdır. Deneyin farklı adımları kesinlik gerektirir. İş istasyonunun mikromanipülasyon bileşenlerinin kullanımı, mikro-aspirasyon sürecini ve hücrenin salınımını gözlemleyerek sürekli kontrol altında olmalıdır. Mikroskobik gözlem ile takip bir hücrenin yakalanması ve transferi için gereklidir. Deneyimli bir operatör 10 hücreleri izole etmek ve izole edilecek virüslerin bolluğuna bağlı olarak tek tek aktarmak i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar hem Jean-Pierre Baudoin ve Olivier Mbarek kendi tavsiye ve Claire Andréani İngilizce düzeltmeler ve değişiklikler ona yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Anr-10-IAHU-03 (Méditerranée Enfeksiyonu) referansı ile “Investissements d’avenir (Gelecek için Yatırımlar)” programı kapsamında Ulusal Araştırma Ajansı tarafından yönetilen Fransız Devleti’nin bağışı ile desteklenmiştir. Côte d’Azur ve Avrupa finansman FEDER PRIMI.
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
- Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
- Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
- Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033 (2003).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
- Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
- Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).
- Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).
- Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300 (2016).
- Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372 (2018).
- Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
- Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
- Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76 (2016).
- Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
- Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).
- Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
- Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278 (2016).
- Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).
- Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
- Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
- Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235 (2018).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
- Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).
- Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).
- Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
- Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
- Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).
- Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).
- Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).
