Summary
Bu rapor, birden fazla hücrenin yüksek verimli eşleştirme ve mikroskobik analizinin sağlanabileceği tek bir hücre kültürü deneyi kurmak için mikroakışkan çip tabanlı bir yöntem tanımlanmaktadır.
Abstract
Hücre ortak kültür tahlilleri yaygın kanser de dahil olmak üzere hastalıkların biyolojisini daha iyi anlamak için farklı hücre tipleri arasındaki hücre-hücre etkileşimleri incelemek için kullanılmıştır. Ancak, geleneksel eş kültür sistemlerini kullanarak son derece heterojen hücre popülasyonlarında hücreler arası etkileşimlerin karmaşık mekanizmasını netleştirmek zordur, çünkü hücre alt popülasyonunun heterojenliği ortalama değerler tarafından gizlenmektedir; geleneksel ortak kültür sistemleri sadece nüfus sinyalini tanımlamak için kullanılabilir, ancak tek tek hücre davranışını izlemekten acizdir. Ayrıca, konvansiyonel tek hücreli deneysel yöntemler Poisson dağılımı nedeniyle hücre manipülasyonu düşük verimlilik var. Mikrofabrikasyon cihazlar tek hücreli çalışmalar için yeni gelişen bir teknolojidir, çünkü tek hücreleri yüksek iş seviyesinde doğru bir şekilde manipüle edebilirler ve numune ve reaktif tüketimini azaltabilirler. Burada, birden fazla tek hücreli ortak kültür için bir mikroakışkan çip in konseptini ve uygulamasını açıklıyoruz. Çip, bir kültür odasında birden fazla hücre türünü verimli bir şekilde yakalayabilir (%~46) ve tek hücre düzeyinde hücre-hücre etkileşimi altında hücrelerin davranışlarını (örneğin, göç, çoğalma, vb.) incelemek için yeterli bir kültür alanına sahiptir. Lenfatik endotel hücreleri ve oral skuamöz hücreli karsinom, çoklu tek hücreli etkileşim çalışmaları için mikroakışkan platformüzerinde tek hücreli ortak kültür deneyi yapmak için kullanıldı.
Introduction
Farklı tipte tek hücrelerin verimli bir şekilde yakalanması ve yeterli kültür alanı sağlanması, tek hücreli birden fazla hücre türünden oluşan tek hücre ortak kültür deneyleri için gereklidir1. Seyreltme sınırlandırılması, gerekli ekipman düşük maliyet nedeniyle, bu tür deneyler için tek hücreleri hazırlamak için en yaygın olarak kullanılan yöntemdir. Ancak, Poisson dağıtım sınırlaması nedeniyle, maksimum tek hücre edinimi olasılığı sadece% 37, deneysel operasyon zahmetli ve zaman alıcı2yapma. Buna karşılık, floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanarak yüksek verimli tek hücreleri hazırlamak için Poisson dağıtım sınırlaması üstesinden gelebilir3. Ancak, facs pahalı enstrümantasyon ve bakım maliyeti nedeniyle bazı laboratuvarlar için erişilebilir olmayabilir. Mikrofabrikasyon cihazlar son zamanlarda tek hücreli yakalama için geliştirilmiştir4, tek hücre eşleştirme5, ve tek hücre kültürü uygulamaları. Bu aygıtlar, tekhücreleridoğru bir şekilde manipüle etme, yüksek işlem denemeleri yapma veya numune ve reaktif tüketimini azaltma yeteneklerine bağlı olarak avantajlıdır 6. Ancak, mevcut mikroakışkan cihazlar ile birden fazla hücre türleri ile tek hücreli co-kültür deneyleri gerçekleştirmek hala Poisson dağılımı1sınırlama nedeniyle zor ,7,8, veya yetersizlik tek hücre4,5,6,9,10ikiden fazla tür yakalamak için cihazlar .
Örneğin, Yoon ve ark. hücre-hücre etkileşimçalışması11için bir mikroakışkan cihaz bildirdi. Bu cihaz, hücreleri tek bir odadaki çiftleri eşleştirmek için olasılıksal yöntemi kullanır. Ancak, aygıt yapısındaki geometrik kısıtlamalar nedeniyle yalnızca iki farklı hücre türünün eşleşmesini sağlayabilir. Lee ve ark. başka bir rapor yakalamak ve tek hücreleri eşleştirmek için deterministik bir yöntem gösterdi12. Bu cihaz deterministik yöntemle eşleştirme verimliliğini artırır, ancak hücreleri eşleştirmek için gereken uzun çalışma süresi ile sınırlıdır. Özellikle, ikinci hücre yakalama sadece ilk yakalanan hücre yüzeye sonra 24 h. Zhao ve ark. tek bir hücre13iki tür yakalamak için bir damlacık tabanlı mikroakışkan cihaz rapor sonra yapılabilir. Damlacık bazlı mikroakışkan cihazın hala Poisson dağılımıile sınırlı olduğunu ve sadece bağlı olmayan hücrelerde kullanılabileceğini ve ekim işlemi sırasında kültür çözümünü değiştirmenin mümkün olmadığını bulduk.
Daha önce, kültür odasına tek hücreli birden fazla türde yakalamak için deterministik hidrodinamik kuvvetleri kullanan ve daha sonra analiz etmek için hücre ortak kültür deneyi gerçekleştirebilen bir mikroakışkan "hidrodinamik kapatma çipi" geliştirdik. hücre-hücre etkileşimleri altında tek tek hücre geçiş davranışı14. Hidrodinamik kapatma çipi, her biri serpantin by-pass kanalı, bir yakalama alanı ve bir kültür odası içeren dizili bir birim kümesinden oluşur. Serpantin by-pass kanalı ile kültür odası arasındaki akış direnci farkı ve özel olarak tasarlanmış bir işlem prosedürü kullanılarak, farklı tipte tek hücreler tekrar tekrar kültür odasına yakalanabilir. Özellikle, kültür odasının geniş alanı sadece hücre yakalama sırasında fışkıran hücre önlemek değil, aynı zamanda hücrelerin yayılması için yeterli alan sağlamak, çoğalmak ve göç, canlı tek hücreetkileşimleri gözlemlemek için izin. Bu makalede, bu cihazın üretimi ve ayrıntılı protokol adımları üzerinde duruluyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yumuşak litografi ile gofret kalıbının imalatı
NOT: Maske deseni verileri önceki yayınımızda mevcuttur14.
- 120 °C'lik fırında 15 dakika boyunca 4 inçlik silikon gofret kurutun.
- Spin kat 4 g SU-8 2 negatif photoresist üzerine 4-inç silikon gofret üzerine 1.000 rpm için 30 s 5 μm kalınlığında tabaka (katman #1) oluşturmak için.
- Yumuşak fırın tabakası 1 dk için 65 ° C hotplate üzerinde #1 ve daha sonra 3 dakika için 95 ° C ocak için #1 katman aktarın.
- Oda sıcaklığına #1 serin tabaka, yarı otomatik maske hizalayıcısının tutucusu üzerine yerleştirin ve #1 krom kaplama fotoğraf maskesi (yakalama-site katmanı) ile hizalayın.
- 150 mJ/cm2dozda 365 nm UV ışığı ile #1 tabakasını teşledin.
- 1 dk. Transfer tabakası #1 1 dk. 1 dk. 1 dk. #1
- Oda sıcaklığına #1 serin tabaka. Bir propilen glikol monometil eter asetat çözeltisi 2 dakika boyunca kesişmemiş fotodirenç yıkamak için batırın #1.
- Bir yapışkan bant ile katman #1 hizalama işareti kapağı, spin kat 4 g SU-8 10 negatif photoresist katman üzerine #1 1.230 rpm 30 s için 25 μm kalınlığında bir tabaka oluşturmak için #2.
- Bant çıkarın, yumuşak fırın tabakası 3 dakika için 65 ° C hotplate #2, ve daha sonra 7 dakika için 95 ° C hotplate #2 katman aktarın.
- Oda sıcaklığına #2 serin katman, katman #2 yarı otomatik maske hizalayıcısının tutucusu üzerine yerleştirin ve katmanı krom kaplama fotoğraf maskesi (bypass kanal katmanı) #2 hizalama #1 hizalama işaretine hizalayın.
- 200 mJ/cm2dozda 365 nm UV ışığı ile #2 tabakasını teşledin.
- 1 dk boyunca 65 °C'lik bir ocakta hizalayıcıdan #2 ve fırından sonra çıkarın ve #2 95 °C'lik bir ocak tan 3 dk aktarın.
- Oda sıcaklığına #2 serin katman ve yapıştırıcı bantla hizalama işareti#1 katmanı kaplayın. Spin kat 4 g SU-8 2050 negatif photoresist katman üzerine #2 1.630 rpm için 30 s bir 100 μm kalınlığında tabaka #3 oluşturmak için.
- 5 dk 65 °C hotplate üzerinde bant, yumuşak fırın tabakası #3 çıkarın ve daha sonra 20 dk için 95 ° C hotplate #3 katman aktarın.
- Oda sıcaklığına #3 serin katman, katman #3 yarı otomatik maske hizalayıcısının tutucusu üzerine yerleştirin ve katmanı krom kaplama fotoğraf maskesi (kültür odası katmanı) #3 hizalama #1 hizalama işaretine hizalayın.
- 240 mJ/cm2dozda 365 nm UV ışığı ile #3 tabakasını teşledin.
- 5 dk. Transfer tabakası #3 10 dk. 95 °C'lik bir ocak tasniki için 65 °C'lik bir ocak tatabınüzerindeki #3 ve pasta sonrası olarak hizalayıcıdan çıkarın.
- Oda sıcaklığına #3 serin tabaka. 10 dakika boyunca kesişmemiş fotodirençleri yıkamak için propilen glikol monometil eter asetat çözeltisine daldırın ve azot gazıyla hafifçe kurulayın.
2. Birden fazla tek hücre yakalama için PDMS cihaz hazırlama
- Gofret kalıbını ve 100 μL triklorosilane içeren tartı kabını bir kurutucuya yerleştirin (sadece silanizasyon için) ve 15 dakika boyunca bir vakum (-85 kPa) uygulayın.
NOT: PdMS dökümden önce hidrofobik yüzey özellikleri oluşturmak için triklorosilane ile gofret yüzeyini silanize edin, böylece gofret PDMS kalıbından zahmetsizce soyulabilir. - Vakumu durdurun ve daha sonra en az 1 saat boyunca 37 °C'de kurutucudaki gofret kalıbını (sadece silanizasyon için) silanize edin.
- PDMS tabanını ve PDMS kür aracıyı 10:1 oranında karıştırın. 15 cm'lik bir tabaktaki gofret kalıbının üzerine toplam 20 gr karışık PDMS dökün.
- Bir kurutucu içine 15 cm çanak yerleştirin ve 1,5 dakika vakum (-85 kPa) uygulayın. Daha sonra 15 cm'lik tabağı kurutucudan çıkarın. Oda sıcaklığında 20 dakika bekletin. Son olarak, azot gazı ile PDMS artık hava kabarcıkları kaldırın.
- PDMS'yi tedavi etmek için 15 cm'lik kabı 65 °C'de 2-4 saat fırında pişirin.
- PDMS kopyasını gofret kalıbından çıkarın ve 1,5 mm iç çapı ve 0,5 mm iç çaplı zımba layıcı kullanarak PDMS'de 1,5 mm giriş ve 0,5 mm çıkış noktası nı delin (Şekil 1C).
- PDMS çoğalmasını ve slayt yüzeyini çıkarılabilir bantla temizleyin ve yüzeyi oksijen plazması ile tedavi edin (14 s için 100 W).
- PDMS yinelemelerini slaytla el ile hizalayın ve birbirleriyle temas edin.
- PDMS slaytını 1 gün boyunca 65 °C'lik bir fırına yerleştirin.
NOT: Aygıt oluşturmak için slayt ve PDMS yinelemesi arasında kalıcı bağ sağlanır. - PDMS cihazını fosfat tamponlu salinle dolu bir kapta batırın ve kurutucuya yerleştirin. Sonra vakum uygulayın (-85 kPa) için 15 dk hava kabarcıkları kaldırmak için.
- PDMS cihazını bir hücre kültürüne yerleştirin ve cihazı UV ışığı (ışık dalga boyu: 254 nm) ile 30 dakika sterilize edin.
- PDMS cihaz tamponu orta (DMEM-F12 bazal orta %1 antibiyotik ve %10 fetal sığır serumu içeren) ile değiştirin ve PDMS cihazını 4 °C'de 1 gün kuluçkaya yatırın. Bu, hücrelerin PDMS yüzeyine yapışmasını önler.
3. Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması
NOT: Hücre tipleri insan lenfatik endotel hücreleri (LECs), insan OSCC TW2.6 hücreleri WNT5B-spesifik shRNA (WNT5B sh4) ve vektör kontrolü (pLKO-GFP) olan önceki çalışma15elde ifade içerir. Ayrıntılı yetiştirme adımları için lütfen önceki yayınımıza bakın.
- Hücreler %70-80 birleştiğinde kültür ortamını kaldırın. Daha sonra hücreleri 5 mL steril PBS ile üç kez hafifçe yıkayın.
- WNT5B sh4 ve pLKO-GFP hücrelerine 1 mm floresan boya içeren 1 mL DMEM-F12 ortamı ekleyin (LED'ler için MV2 ortamı kullanın) ve daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: LEC'ler yeşil klorometilflorescein diasetat (CMFDA) Boya, WNT5B sh4 hücreleri mavi 7-amino-4-kloromtilcoumarin (CMAC) Boya ve pLKO-GFP hücreleri ile boyanmış kırmızı Dil floresan boya ile boyanmıştır. - Hücreleri 5 mL steril PBS ile üç kez hafifçe yıkayın.
- PBS'yi çıkarın ve 2 mL %0,25 Tripsin-EDTA ekleyin (%0,05 LEC'ler için Trypsin-EDTA).
- Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın ve sonra yavaşça hücrelerin ayrılmasıteşvik etmek için doku kültürü çanak dokunun.
- WNT5B sh4 ve pLKO-GFP hücrelerini dağıtmak için 4 mL DMEM-F12 ortamı ekleyin (LEC'ler için 3 mL MV2 orta ve 1 mL tripsin nötrleştirici çözeltisi kullanın). Daha sonra hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 3 00 0 0'da santrifüj edin.
- Süpernatant'ı çıkarın ve hücre peletini 1 mL DMEM-F12 ortasında hafifçe yeniden askıya alın. Standart Trypan Mavi dışlama yöntemi16kullanarak hemositometredeki canlı hücre sayısını sayın. DMEM-F12 ortamlarında 3 x 105 hücre/mL konsantrasyonunda 1 mL hücre süspansiyonu hazırlayın ve hücre agregasını önlemek için hücreleri buzda tutun.
NOT: Tek hücreli yakalama verimliliğini artırmak için, tek hücreli süspansiyonun iyi ayrıştırılmış olarak dikkatli hazırlanması gerekmektedir.
4. Birden fazla tek hücreli yakalama ve üçlü tek hücrekültürü
- Cihazın çıkışı ile şırınga pompası arasında bir poli-tetrafloroethene (PTFE) tüp bağlayın. Ortamı çıkarın ve PDMS cihazının girişine 3 x 105 hücre/mL konsantrasyonla 1 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
- Hücre süspansiyonunun 0,3 μL/dk akış hızında bir şırınga pompası ile cihaza yüklenmesi(Şekil 2A). Akış yönü girişten çıkışa kadardır.
NOT: Hücre sedimantasyonunu önlemek için hücre süspansiyonunu girişe ekledikten hemen sonra yükleyin. - 4.2.Adımdan sonra PDMS cihazının girişine 1 μL DMEM-F12 ortamı ekleyin.DMEM-F12 ortamını 0,3 μL/dk akış hızında bir şırınga pompası ile cihaza yükleyin (Şekil 2B). Akış yönü girişten çıkışa doğru akıyordu.
- Cihaza 0,3 μL DMEM-F12 ortamını 10 μL/dk akış hızında bir şırınga pompası ile yükleyin (Şekil 2C). Akış yönü çıkıştan girişe doğru akıyordu.
- Diğer hücre türlerini aygıta yüklemek için 4,1 ile 4,4 adımlarını yineleyin.
- Hücre yakalama tamamladıktan sonra, her kültür odası görüntü 4x lens ile bir mikroskop kullanın.
NOT: Hücrelerin floresan emisyonları, her kültür odasındaki tek tek hücrelerin sayısını belirlemek ve saymak için kullanılmıştır. - PTFE tüpünü çıkarın ve kapalı bir kültür sistemi oluşturmak için giriş ve prizini pololefin bantla kapatın.
- PDMS cihazını 10 cm'lik bir kültür kabına taşıyın ve cihazın buharlaşmasını önlemek için PDMS cihazının etrafına 10 mL steril PBS ekleyin.
- Kültür çanamasını üçlü tek hücreli kültür için bir kuluçka makinesine (37 ° C, %5 CO2 ve %95 nem) aktarın.
- Mikroskopik gözlemlemek ve fotoğraf hücre büyüme her 12 saat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cihaz, kesilmiş bir PDMS aygıtının kesit fotoğrafından gösterildiği gibi üç katmanlı bir yapıya sahiptir(Şekil 1A). İlk katman, kültür odasını ve by-pass kanalını birbirine bağlayan bir yakalama alanı (6,0 μm genişliğinde ve 4,6 m yüksekliğinde) içerir. Kültür odası ve by-pass kanalı arasındaki akış direnci farkı hücrelerin yakalama konumuna akmasına ve küçük yolun girişini doldurmasına neden olur. Bir hücre yakalama konumunda yakalandıktan sonra, küçük yolun akış direnci artırılır ve bir sonraki gelen hücrenin bir sonraki alt akış yakalama bölgesine by-pass kanalına doğru ve by-pass kanalından geçmesine neden olur. İkinci katmanın by-pass kanalının serpantin tasarımı (25.0 m genişliğinde ve 26.4 m yüksekliğinde) akış direncini artırmak için kullanılır. Üçüncü katmandaki kültür odasının boyutları (500,3 μm çapında ve 111,3 m yüksekliğinde) hücre kültürü deneyi için yeterli alan sağlamak ve hücrelerin odadan dışarı atmasını engellemek için odadaki akış hızını azaltmak için tasarlanmıştır.
Operasyon prosedürü için gerekli araçlar(Şekil 2)mikroskop, şırınga pompası, cam şırınga, santrifüj tüpü, tüp ve pipet dahil olmak üzere genel laboratuvarlarda yaygındır. Cihaz yaklaşık 1/5 2 mm kalınlığında bir coverslip ve 4x ila 20x lens ile bir mikroskop altında gözlemlemek için uygundur. Bu yöntemle, tek hücreler için bir tip 7 dk altında kültür odalarında yakalanabilir, böylece üçlü tek hücrelerin toplam çalışma süresi 21 dk'dan azdır. Gösterilen üç hücrenin tek hücre yakalama etkinliği sırasıyla %70,83 ± %15,42 (LEC), %73,96 ± %14,09 (WNT5B sh4) ve %78,13 ± %3,13 (pLKO-GFP) idi. Üçlü tek hücre yakalama verimi %47.92 ± %7.86 idi (Şekil 3B). Reflü operasyonu adımı, hücreleri aynı anda yakalama bölgelerinden serbest bırakmak ve hücreleri kültür odalarına akışiçin kullanılır (Şekil 2C). Bu işlem sırasında, bir hücre yakalama alanından serbest bırakılmazsa, alt akış yakalama yerindeki serbest bırakılan hücre, kültür odasından daha düşük akış direncine sahip by-pass kanalı nedeniyle kültür odasına girmez. Bu, HSC'nin sadece %47,92 ± %7,86 üçlü tek hücre yakalama verime sahip olmasının başlıca nedenidir ve bu da poisson dağılımı olasılığından hala önemli ölçüde daha fazladır (%~5)..
Hücre kültürü sonuçları, lenfatik endotel hücrelerinin ve skuamöz kanser hücrelerinin birden fazla tek hücreli ko-kültürlerinin 24 saat boyunca yapAbİlebileceğini ve hücrelerin çoğalması ve morfolojisinin mikroskop altında görülebileceğini göstermiştir(Şekil 4, Ek Videolar 1-3). pLKO-GFP hücrelerinin varlığında, WNT5B sh4 hücreleri ve LEC'ler daha iyi proliferatif kapasite gösterdi ve morfolojinin lamellipodia'ya yaklaştığını gösterdi. Bu sonuçlar, bu aygıtın bir kültür odasında birden fazla hücre türünü yüksek verimli bir şekilde yakalama yeteneğini gösterir ve birden çok hücre tipi etkileşimi incelemek için yararlı yeterli bir kültür alanı sağlar.
Şekil 1: Hidrodinamik kapatma yongasının fotoğraf ve mikroskop görüntüleri. (A) PDMS kesit görünümünün mikroskop görüntüsü. (B) Büyütülmüş görünümün tek bir hücre yakalama birimi. (C) 48 birimiçeren çipin görünümü. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hidrodinamik kapatma talaş işlemi. (A) By-pass kanalının yüksek hidrodinamik direnci nedeniyle, tek bir hücre yakalama bölgesinde sıkışıp kalır. (B) İlk hücre kapana kısıldıktan ve yakalama bölgesini tıkadıktan sonra, aşağıdaki hücreler artan akış direnci nedeniyle by-pass kanalına doğru akar. Kalan hücreleri kanalda yıkamak için orta kullanın. (C) Reflü hücre kültür odasına. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hidrodinamik kapatma yongasında LED' ler, WNT5B sh4 ve pLKO-GFP'nin tek hücre yakalama verimi. (A) Kültür odasında yakalanan üçlü tek hücrelerin mikroskop görüntüsü. (B) Yeşil, mavi ve kırmızı çubuklar sırasıyla tek tek hücrelerin yakalama verimliliğini temsil eder ve sarı çubuklar üçlü tek hücreli hücreyakalama verimliliğini temsil eder. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hidrodinamik kapatma yongasında 24 saat boyunca eşleştirilmiş tek hücreli ortak kültür ve üçlü tek hücreli ortak kültür. (A) 0, 12 ve 24 h.(B) PLKO-GFP ve WNT5B sh4 hücrelerinin mikroskop görüntüsü 0, 12 ve 24 h. LEC'ler yeşil CMFDA Boyası, WNT5B sh4 hücreleri mavi CMAC Boya ile boyanmış ve pLKO-GFP hücreleri kırmızı DiI floresan boya ile boyandı. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 1: Hücre Yükleme. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Ek Video 2: Hücre Reflü. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Ek Video 3: Kültür odasına ikinci hücre tipi reflü. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tümör mikroortamında çeşitli hücrelerin hücreler arası etkileşimleri tümörün ilerlemesinde önemli bir rol oynamaktadır17. Hücre-hücre etkileşimlerinin mekanizmasını anlamak için ortak bir analitik yöntem olarak ortak kültür sistemleri kullanılmaktadır. Ancak, birden fazla hücre tipleri ve hücrelerin heterojenliği deneysel karmaşıklık ve analitik zorluklara yol açmıştır.
Hidrodinamik kapatma çipi, seyreltme yöntemi ve mikrokuyu platformundaki Poisson dağıtım sınırlaması ile sınırlandırılmadan, deterministik bir yöntemle kültür odasında birden fazla tek hücreli yüklemeye olanak tanır. Yüksek üçlü tek hücre yakalama verimi sağlayarak (%45'ten fazla, Poisson dağıtım yöntemi %5'tir) ve kültür odasında, uzayın hücre büyümesi ve çoğalması için yeterli olduğunu göstermektedir (Şekil 4). Basit kurulum ve protokol ile birden fazla tek hücreli yakalama ve canlı hücre kültürü gözlemlerini verimli bir şekilde gerçekleştirebilme becerisi sayesinde, bu mikroakışkan cihazları hücre hücresi de dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için yararlı araçlar olarak öngörüyoruz. çoklu hücreler arasındaki etkileşimler18, ilaç tarama19, ve kanserbiyolojisi 20. Öte yandan, cihaz yapısı kalıplanabilir ve yakalama alanının yapısı ve boyutu değiştirilebilir ve mikroorganizmalar ve bitki hücreleri gibi diğer alanlara uygulanabilir. Teoride, yöntemimiz mikrobiyal ortak kültürlerin (örn. bakteriler, mayalar, vb.) kurulması ve izlenmesi için de uyarlanabilir.
Bu yaklaşımın temel sınırlaması, cihaz imalatı için gereken hassas seviyenin yüksek olmasıdır. Bunun başlıca nedeni, en küçük kanalın akış direncinin, imal edilmiş boyutları hafifçe dengelenirse önemli ölçüde değiştirilebilmelidir. Mikro kanalların dirençlerinin kontrolü cihazın yüksek verimli tek hücreli yakalanması için çok önemlidir. Öte yandan, hücre kültürü sırasında, odalar arasında bir kapatma yoktur. Bu nedenle, odadaki hücrelerin parakrin salgıları diğer hücreleri etkilemek için diğer odalara yayılabilir. Son olarak, cihazın hazırlanması sırasında kanal ve boru temizliğine dikkat edilmelidir. Kültür ortamı ve deneyde kullanılan herhangi bir arabellek parçacıklar ve enkaz kanalı engellemesini önlemek için filtre edilmesi gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.
Acknowledgments
Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (105-2628-E-400-001-MY2) ve Doku Mühendisliği ve Rejeneratif Tıp Doktora Programı, Ulusal Chung Hsing Üniversitesi ve Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
