فحص خليه الضامة مراسل لفحص الأرقام مثل مستقبلات بوساطة NF-kB/AP-1 إشارات علي طبقات البروتين الممتف علي الأسطح البوليمريه
Summary
يوفر هذا البروتوكول للباحثين طريقه سريعة وغير مباشره لقياس نشاط عامل النسخ NF-кB/AP-1 المعتمد علي TLR في خط خلايا الضامة في الاستجابة لمجموعه متنوعة من الأسطح البوليمريه وطبقات البروتين الممتصة التي تقوم بنمذجة البيئة المجهرية للزرع.
Abstract
استجابه المضيف التهابيه المستمرة للمواد البيولوجية المزروعة ، والمعروفة باسم رد فعل الجسم الأجنبي ، تمثل تحديا كبيرا في تطوير وتنفيذ الاجهزه الطبية الحيوية وتركيبات هندسه الانسجه. الضامة ، خليه مناعية فطريه ، هي اللاعبين الرئيسيين في رد فعل الجسم الأجنبي لأنها تبقي في موقع الزرع لعمر الجهاز ، وتدرس عاده للحصول علي فهم لهذه الاستجابة المضيف الضارة. وقد أظهرت العديد من الباحثين حيوي ان طبقات البروتين الممتد علي المواد المزروعة تؤثر علي سلوك الضامة ، وبعد ذلك تؤثر علي استجابه المضيف. تصف الطرق في هذه الورقة نموذجا في المختبر باستخدام طبقات البروتين الممتصة التي تحتوي علي جزيئات التلف الخلوي علي أسطح البوليمرات الحيوية لتقييم استجابات الضامة. تم استخدام NF-кB/AP-1 مراسل خط الخلايا الضامة والمقايسة الفوسفاتيز القلوية اللونية المرتبطة كطريقه سريعة لفحص غير مباشر NF-кB/AP-1 نشاط عامل النسخ استجابه لطبقات البروتين الممتدة المعقدة التي تحتوي علي بروتينات الدم والأنماط الجزيئية المرتبطة بالتلف ، كنموذج لطبقات البروتين الممتدة المعقدة التي تتشكل علي الأسطح الحيوية في الجسم الحيوي.
Introduction
رد فعل الجسم الخارجي (FBR) هو استجابه المضيف المزمنة التي يمكن ان تؤثر سلبا علي أداء المواد المزروعة أو الجهاز (علي سبيل المثال ، أجهزه تسليم المخدرات ، والمواد البيولوجية) ، من خلال الإفراج المستمر من الوسطاء التهابيه وعرقله التكامل بين المادة المزروعةوالانسجه ال ويبدا هذا الاستجابة المناعية الفطرية من خلال اجراء الغرس ويتميز بوجود طويل الأمد للخلايا المناعية الفطرية وتشكيل كبسوله ليفية حول زرع1. في سياق الاستجابات المضيفة المادية ، والتفاعلات الضامة المادية لها تاثير كبير علي تطور استجابه المضيف وتطوير FBR1. الضامة هي مجموعه متنوعة من الخلايا المناعية الفطرية, المجندين في موقع الزرع اما من السكان الضامة الانسجه المقيمين أو من الدم كالضامة المشتقة من الخلايا الاحاديه. يبدؤون في التراكم في موقع الزرع بعد فتره وجيزة من الغرس ، وفي غضون أيام تصبح الخلايا المهيمنة في البيئة المجهرية المزروعة. المواد-الضامة ملتصقة ، جنبا إلى جنب مع خلايا الجسم العملاقة الاجنبيه (fbgc) شكلت من خلال الانصهار الضامة ، يمكن ان تستمر علي سطح المادة لعمر الزرع2،3. التالي, تعتبر الضامة لتكون اللاعبين الرئيسيين في استجابه الجسم الأجنبي بسبب أدوارهم تدبير الخطوات المميزة لل FBR: استجابه التهابيه حاده, أعاده عرض الانسجه, وتشكيل الانسجه الليفية1.
مستقبلات مثل الأرقام (TLRs) هي عائله من مستقبلات التعرف علي النمط التي يتم التعبير عنها من قبل العديد من الخلايا المناعية, بما في ذلك الضامة, وقد ثبت ان تلعب دورا هاما في التهاب والتئام الجروح. بالاضافه إلى العوامل المسببة للمرض ، TLRs قادره علي ربط الجزيئات الذاتية ، والمعروفة باسم الاضرار المرتبطة الأنماط الجزيئية (DAMPs) ، والتي يتم تحريرها اثناء نخر الخلية وتنشيط مسارات الإشارات التهابيه مما ادي إلى إنتاج السايتوكينات التهابيه4. وقد اقترحنا نحن والآخرين ان الضرر المتكبدة خلال الانسجه الرخوة الحيوية إجراءات الزرع الإفراج damps ، التي كثفت بعد ذلك إلى الأسطح الحيوية بالاضافه إلى بروتينات الدم وتعدل التفاعلات اللاحقة الخلية المادية5،6. عندما تتفاعل الضامة مع طبقه البروتين الممتص علي الزرع ، قد تتعرف علي سطحها TLRs تكثيف DAMPs وتنشيط السلاسل التعاقبية الإشارات التهابيه ، مما يؤدي إلى NF-κB و AP-1 عامل النسخ التنشيط وإنتاج السايتوكينات التهابيه. لقد أظهرنا سابقا ان الضامة murine قد زادت بشكل ملحوظ NF-κB/AP-1 النشاط وعامل نخر الورم α (TNF-α ، إفراز التهابات الخلوية) في الاستجابة لطبقات البروتين الممتزات التي تحتوي علي الرطوبة علي مجموعه متنوعة من الأسطح البوليمريه مقارنه بالأسطح مع مصل الممتزات أو البلازما فقط (اي ، لا يوجد DAMPs الحالية) ، وان هذا الرد توسط إلى حد كبير من قبل TLR2 ، في حين TLR4 يلعب دورا اقل5.
و nf-κb/AP-1 مراسل الضام خط الخلية (جدول المواد) المستخدمة في هذا البروتوكول هو وسيله مريحه لقياس النسبية NF-κb و AP-1 النشاط في الضامة5،7،8. في تركيبه مع مثبطات مسار tlr ، هذا الخط خليه أداه مفيده للتحقيق التنشيط tlr ودوره في التهاب استجابه لمجموعه متنوعة من المحفزات5،7،8. الخلايا المراسلة هي الماوس تعديل الضامة مثل خط الخلية التي يمكن ان تنتج بشكل ثابت يفرز الفوسفاتيز القلوية الجنينية (SEAP) علي NF-κB و AP-1 عامل النسخ تفعيل9. ويمكن بعد ذلك استخدام المقايسة الفوسفاتيزه القلوية الانزيميه الملونة (جدول المواد) لقياس الكميات النسبية للتعبير seap كمقياس غير مباشر للنشاط NF-κb/AP-1. كما NF-κB و AP-1 هي المصب من العديد من مسارات إشارات الخلية ، وتحييد الأجسام المضادة والمثبطات التي تستهدف TLRs محدده (علي سبيل المثال ، TLR2) أو الجزيئات محول TLRS (علي سبيل المثال ، MyD88) يمكن استخدامها للتحقق من دور مسار معين. توفر المنهجية الموصوفة في هذه المقالة نهجا بسيطا وسريعا لتقييم مساهمه الإشارات TLR في استجابات الضامة murine إلى مجموعه متنوعة من الأسطح البوليمريه مع طبقات البروتين الممتص التي تحتوي علي كل من بروتينات الدم و DAMPs كنموذج في المختبر من الحيوي المزروعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
التركيز الأساسي لمعملنا هو استجابه المضيف لعمليات زراعه الانسجه الرخوة الصلبة ، وعلي وجه الخصوص كيف تؤثر الاضرار الخلوية المتكبدة اثناء اجراء الغرس علي استجابه المضيف. يصف العمل المعروض هنا التجارب الاوليه باستخدام خط خليه الضامة مراسل وفي المختبر الذي يحتوي علي الرطوبة الخلوية التي تح…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعرب المؤلفون عن امتنانهم للتمويل التشغيلي من مشروع المعاهد الكندية للبحوث الصحية (PTJ 162251) ، ولجنه البحوث الاستشارية التابعة لمجلس الشيوخ بجامعه الملكة ، ودعم البنية التحتية من صندوق جون ايفان للقيادة التابع للمؤسسة الكندية للابتكار (34137 المشروع 34137). وقد دعمت L.A.M. من قبل جامعه الملكة r. صموئيل ماكلولين الزمالة ، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث الكندية جائزه الماجستير في المنح الدراسية الدراسات العليا والدراسات العليا في اونتاريو. ويود المؤلفون ان يشكروا الدكتور ميرون سيتشووك علي هديته السخية من الخط الخلوي “NF-κB/AP-1” و “Drs”. مايكل بلينهاسيت وساندرا لورنزو لاستخدامها نظام التصوير هلام وقارئ لوحه.
Materials
| Cell culture reagents | |||
| anti-mouse/human CD282 (TLR2) | Biolegend | 121802 | |
| CLI-095 (TLR4 inhibitor) | Invivogen | TLRL-CLI95 | |
| C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin | InnovativeResearch | IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml | Mouse plasma |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D6429-500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Fisher Scientific | 14190250 | No calcium, no magnesium |
| Fetal bovine serum (FBS), research grade | Wisent | 98150 | |
| LPS-EK | Invivogen | TLRL-EKLPS | Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 |
| NIH/3T3 fibroblasts | ATCC | CRL-1658 | |
| Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | Synthetic triacylated lipopeptide – TLR1/2 ligand |
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-100ML | |
| Plasmocin | Invivogen | ANT-MPP | Mycoplasma elimination reagent |
| RAW-Blue cells | Invivogen | raw-sp | NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line |
| Trypan blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE express enzyme (1X) | Fisher Scientific | 12604021 | animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme |
| Zeocin | Invivogen | ANT-ZN-1 | |
| Kits and assays | |||
| ELISA precoated plates, mouse IL-6 | Biolegend | B213022 | |
| ELISA precoated plates, mouse TNF-α | Biolegend | B220233 | |
| Endotoxin (Escherichia coli) – Control standard endotoxin (CSE) | Associates of Cape Cope Inc. | E0005-5 | Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay |
| LAL water, 100 mL | Associates of Cape Cope Inc. | WP1001 | Used with chromogenic endotoxin assay |
| Micro BCA protein assay | Fisher Scientific | PI23235 | |
| Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit | Associates of Cape Cope Inc. | C1500-5 | Chromogenic endotoxin assay reagent |
| QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium | Invivogen | rep-qb2 | Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity |
| Polymeric coating reagents | |||
| Chloroform, anhydrous | Sigma Aldrich | 288306-1L | |
| Ethyl alcohol anhydrous | Commercial Alcohols | P006EAAN | Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L |
| Straight tapered fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-113 | |
| Fluorinert FC-40 solvent | Sigma Aldrich | F9755-100ML | Fluorinated solvent for fPTFE |
| Cell culture grade water (endotoxin-free) | Fisher Scientific | SH30529LS | |
| Poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Sigma Aldrich | 182230-25G | |
| Sylgard 184 elastomer kit | Fisher Scientific | 50822180 | |
| Teflon-AF (fPTFE) | Sigma Aldrich | 469610-1G | Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene] |
| Consumables | |||
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Axygen microtubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-222-155 | |
| Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| Clear PS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-52 | |
| Clear TCPS 96-well plate | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| Clear TCPS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-1C | |
| Cover glasses, circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Falcon tissue culture treated flasks, T25 | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| sticky-Slide 8 Well | Ibidi | 80828 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue culture treated flasks, T150 | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
References
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 86-100 (2008).
- Anderson, J. M., Miller, K. M. Biomaterial biocompatibility and the macrophage. Biomaterials. 5 (1), 5-10 (1984).
- Collier, T. O., Anderson, J. M. Protein and surface effects on monocyte and macrophage adhesion, maturation, and survival. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (3), 487-496 (2002).
- Bianchi, M. E. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. Journal of Leukocyte Biology. 81 (1), 1-5 (2007).
- McKiel, L. A., Fitzpatrick, L. E. Toll-like Receptor 2-Dependent NF-κB/AP-1 Activation by Damage-Associated Molecular Patterns Adsorbed on Polymeric Surfaces. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3792-3801 (2018).
- Babensee, J. E. Interaction of dendritic cells with biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 101-108 (2008).
- Sintes, J., Romero, X., de Salort, J., Terhorst, C., Engel, P. Mouse CD84 is a pan-leukocyte cell-surface molecule that modulates LPS-induced cytokine secretion by macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 88 (4), 687-697 (2010).
- Tom, J. K., Mancini, R. J., Esser-Kahn, A. P. Covalent modification of cell surfaces with TLR agonists improves and directs immune stimulation. Chemical Communications. 49 (83), 9618-9620 (2013).
- Abdulkhalek, S., et al. Neu1 sialidase and matrix metalloproteinase-9 cross-talk is essential for toll-like receptor activation and cellular signaling. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36532-36549 (2011).
- Gorbet, M. B., Sefton, M. V. Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials. 26 (34), 6811-6817 (2005).
- Xing, Z., Pabst, M. J., Hasty, K. A., Smith, R. A. Accumulation of LPS by polyethylene particles decreases bone attachment to implants. Journal of Orthopaedic Research. 24 (5), 959-966 (2006).
- Ding, H., et al. Comparison of the cytotoxic and inflammatory responses of titanium particles with different methods for endotoxin removal in RAW264.7 macrophages. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 23 (4), 1055-1062 (2012).
- Hoogenboom, R., Becer, C. R., Guerrero-Sanchez, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Solubility and thermoresponsiveness of PMMA in alcohol-water solvent mixtures. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1173-1178 (2010).
- Efimenko, K., Wallace, W. E., Genzer, J. Surface modification of Sylgard-184 poly(dimethyl siloxane) networks by ultraviolet and ultraviolet/ozone treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 254 (2), 306-315 (2002).
- Godek, M. L., Sampson, J. A., Duchsherer, N. L., McElwee, Q., Grainger, D. W. Rho GTPase protein expression and activation in murine monocytes/macrophages is not modulated by model biomaterial surfaces in serum-containing in vitro cultures. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 17 (10), 1141-1158 (2006).
- Park, J. S., et al. Involvement of Toll-like Receptors 2 and 4 in Cellular Activation by High Mobility Group Box 1 Protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (9), 7370-7377 (2004).
- Ohashi, K., Burkart, V., Flohé, S., Kolb, H. Cutting Edge: Heat Shock Protein 60 Is a Putative Endogenous Ligand of the Toll-Like Receptor-4 Complex. The Journal of Immunology. 164 (2), 558-561 (2000).
- Wong, T., McGrath, J. A., Navsaria, H. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration. British Journal of Dermatology. 156 (6), 1149-1155 (2007).
- van Wachem, P. B., et al. The influence of protein adsorption on interactions of cultured human endothelial cells with polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 21 (6), 701-718 (1987).
- Miller, K. M., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage activation and interleukin 1 generation by biomedical polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 22 (8), 713-731 (1988).
- Bonfield, T. L., Colton, E., Anderson, J. M. Plasma protein adsorbed biomedical polymers: Activation of human monocytes and induction of interleukin 1. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (6), 535-548 (1989).
- González, O., Smith, R. L., Goodman, S. B. Effect of size, concentration, surface area, and volume of polymethylmethacrylate particles on human macrophages in vitro. Journal of Biomedical Materials Research. 30 (4), 463-473 (1996).
- Anderson, J. M., et al. Protein adsorption and macrophage activation on polydimethylsiloxane and silicone rubber. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 7 (2), 159-169 (1995).
- Lord, M. S., Foss, M., Besenbacher, F. Influence of nanoscale surface topography on protein adsorption and cellular response. Nano Today. 5 (1), 66-78 (2010).
- Chen, S., et al. Characterization of topographical effects on macrophage behavior in a foreign body response model. Biomaterials. 31 (13), 3479-3491 (2010).
- Shen, M., Horbett, T. A. The effects of surface chemistry and adsorbed proteins on monocyte/macrophage adhesion to chemically modified polystyrene surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 57 (3), 336-345 (2001).
- Love, R. J., Jones, K. S. The recognition of biomaterials: Pattern recognition of medical polymers and their adsorbed biomolecules. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (9), 2740-2752 (2013).
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Phenotypic expression in human monocyte-derived interleukin-4-induced foreign body giant cells and macrophages in vitro: Dependence on material surface properties. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1380-1390 (2015).
- Gambhir, V., et al. The TLR2 agonists lipoteichoic acid and Pam3CSK4 induce greater pro-inflammatory responses than inactivated Mycobacterium butyricum. Cellular Immunology. 280 (1), 101-107 (2012).
- Suzuki, O., Yagishita, H., Yamazaki, M., Aoba, T. Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Octacalcium Phosphate and its Hydrolyzates. Cells and Materials. 5 (1), 45-54 (1995).
- Johnston, R. L., Spalton, D. J., Hussain, A., Marshall, J. In vitro protein adsorption to 2 intraocular lens materials. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 25 (8), 1109-1115 (1999).
- Jin, J., Jiang, W., Yin, J., Ji, X., Stagnaro, P. Plasma proteins adsorption mechanism on polyethylene-grafted poly(ethylene glycol) surface by quartz crystal microbalance with dissipation. Langmuir. 29 (22), 6624-6633 (2013).
- Swartzlander, M. D., et al. Linking the foreign body response and protein adsorption to PEG-based hydrogels using proteomics. Biomaterials. 41, 26-36 (2015).
- Chamberlain, M. D., et al. Unbiased phosphoproteomic method identifies the initial effects of a methacrylic acid copolymer on macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (34), 10673-10678 (2015).
- Dillman, W. J., Miller, I. F. On the adsorption of serum proteins on polymer membrane surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 44 (2), 221-241 (1973).
- Ishihara, K., Ziats, N. P., Tierney, B. P., Nakabayashi, N., Anderson, J. M. Protein adsorption from human plasma is reduced on phospholipid polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (11), 1397-1407 (1991).
- Warkentin, P., Wälivaara, B., Lundström, I., Tengvall, P. Differential surface binding of albumin, immunoglobulin G and fibrinogen. Biomaterials. 15 (10), 786-795 (1994).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 33 (5), 443-454 (2010).
- Zhang, Y., Karki, R., Igwe, O. J. Toll-like receptor 4 signaling: A common pathway for interactions between prooxidants and extracellular disulfide high mobility group box 1 (HMGB1) protein-coupled activation. Biochemical Pharmacology. 98 (1), 132-143 (2015).
- Mizel, S. B., Honko, A. N., Moors, M. A., Smith, P. S., West, A. P. Induction of macrophage nitric oxide production by Gram-negative flagellin involves signaling via heteromeric Toll-like receptor 5/Toll-like receptor 4 complexes. Journal of Immunology. 170 (12), 6217-6223 (2003).
- Das, N., et al. HMGB1 Activates Proinflammatory Signaling via TLR5 Leading to Allodynia. Cell Reports. 17 (4), 1128-1140 (2016).
- Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 Receptor Differentially Couples to Distinct Release Pathways for IL-1β in Mouse Macrophage. The Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
- Tak, P. P., Firestein, G. S. NF-κB: A key role in inflammatory diseases. Journal of Clinical Investigation. 107 (1), 7-11 (2001).
- Ashkenazi, A., Dixit, V. M. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281 (5381), 1305-1308 (1998).
- Erridge, C. Endogenous ligands of TLR2 and TLR4: agonists or assistants. Journal of Leukocyte Biology. 87 (6), 989-999 (2010).
- Feng, Y., et al. A macrophage-activating, injectable hydrogel to sequester endogenous growth factors for in situ angiogenesis. Biomaterials. 134, 128-142 (2017).
- Lonez, C., et al. Cationic lipid nanocarriers activate Toll-like receptor 2 and NLRP3 inflammasome pathways. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 10 (4), 775-782 (2014).
