Een macrophage reporter Celassay om Tolachtige receptor-gemedieerde NF-kB/AP-1-signalering op geadsorbeerde proteïne lagen op polymere oppervlakken te onderzoeken
Summary
Dit protocol biedt onderzoekers een snelle, indirecte methode voor het meten van TLR-afhankelijke NF-кB/AP-1 transcriptiefactor-activiteit in een muriene macrofaag cellijn in reactie op een verscheidenheid aan polymere oppervlakken en geadsorbeende eiwit lagen die de micro omgeving van het biomateriaal implantaat modelleren.
Abstract
De aanhoudende inflammatoire gastheer reactie op een geïmplanteerd biomateriaal, bekend als de reactie van het vreemde lichaam, is een belangrijke uitdaging in de ontwikkeling en implementatie van biomedische apparaten en weefsel engineering constructies. Macrofagen, een aangeboren immuuncel, zijn belangrijke spelers in de reactie van het vreemde lichaam omdat ze op de implantatieplaats blijven gedurende de levensduur van het apparaat, en worden vaak bestudeerd om een goed begrip te krijgen van deze nadelige reactie van de gastheer. Veel biomaterialen onderzoekers hebben aangetoond dat geadsorlageerde proteïne lagen op geïmplanteerde materialen het macrofaag gedrag beïnvloeden en vervolgens invloed hebben op de reactie van de gastheer. De methoden in dit artikel beschrijven een in vitro model met behulp van geadsorpete eiwit lagen met cellulaire schade moleculen op polymeer biomateriaal oppervlakken om macrofaag reacties te beoordelen. Een NF-кb/AP-1 reporter macrofaag cellijn en de bijbehorende colorimetrische alkalische fosfatase assay werden gebruikt als een snelle methode om indirect te onderzoeken NF-кb/AP-1 transcriptiefactor activiteit in reactie op complexe geadsorbeerden eiwit lagen met bloed eiwitten en schade-geassocieerde moleculaire patronen, als model van de complexe geadsorreven proteïne lagen gevormd op biomateriaal oppervlakken in vivo.
Introduction
De reactie van het vreemde lichaam (FBR) is een chronische reactie van de gastheer die een negatieve invloed kan hebben op de prestaties van een geïmplanteerd materiaal of apparaat (bijv. medicatie bezorgings apparatuur, biosensoren), door de aanhoudende afgifte van ontstekingsmediatoren en door het belemmeren van de integratie tussen het geïmplanteerde materiaal en het omringende weefsel1. Deze aangeboren immuunrespons wordt geïnitieerd door de implantatie procedure en wordt gekenmerkt door de langdurige aanwezigheid van aangeboren immuuncellen en vezelig capsule vorming rond het implantaat1. Binnen de context van materiële gastheer reacties, macrofaag-materiaal interacties hebben een aanzienlijke invloed op de progressie van de reactie van de gastheer en de ontwikkeling van een FBR1. Macrofagen zijn een gevarieerde aangeboren immuuncelpopulatie, die wordt gerekruteerd op de implantatieplaats, hetzij van weefsel-Resident macrofaag populaties of van het bloed als monoyte-afgeleide macrofagen. Ze beginnen zich op de implantatieplaats te accumuleren kort na de inplanting en worden binnen enkele dagen de overheersende celpopulatie in de micro omgeving van het implantaat. Materiaal aanhechting macrofagen, samen met vreemde lichaam reuscellen (fbgc) gevormd door macrofaag fusie, kan aanhouden op het materiële oppervlak voor de levensduur van het implantaat2,3. Bijgevolg worden macrofagen beschouwd als belangrijke spelers in de reactie van het buitenlandse lichaam als gevolg van hun rollen die de karakteristieke stappen van de FBR indelen: acute inflammatoire respons, weefsel remodellering, en vorming van fibrotische weefsel1.
Toll-achtige receptoren (TLRs) zijn een familie van patroon erkenning receptoren die worden uitgedrukt door vele immuuncellen, met inbegrip van macrofagen, en is aangetoond dat het spelen van een belangrijke rol bij ontsteking en wondgenezing. Naast pathogenen afgeleide liganden, kunnen Tlr’s endogene moleculen binden, bekend als schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs), die vrijkomen tijdens celnecrose en ontstekings signalerings trajecten activeren, resulterend in de productie van proinflammatoire cytokines4. Wij en anderen hebben voorgesteld dat schade die is opgelopen tijdens implantatie procedures voor zacht weefsel biomateriaal, de Damps, die vervolgens worden geadsord aan biomateriale oppervlakken in aanvulling op bloed proteïnen, en de daaropvolgende celmateriaalinteracties met een moduleren van5,6. Wanneer macrofagen interactie met de geadsorbende proteïne-laag op een implantaat, hun oppervlak TLRs kunnen geadsorberen DAMPs herkennen en activeren proinflammatoire signalering Cascades, wat leidt tot NF-κB en AP-1 transcriptiefactor activering en productie van proinflammatoire cytokines. We hebben eerder aangetoond dat Murine macrofagen significant hebben verhoogd NF-κB/AP-1 activiteit en tumor necrose factor α (TNF-α, proinflammatoire cytokine) secretie in reactie op vocht bevattende geadsorbeerde eiwit lagen op verschillende polymere oppervlakken in vergelijking met oppervlakken met geadsorbeerd serum of plasma (d.w.z. geen DAMPs aanwezig), en dat deze respons grotendeels wordt gemedieerd door TLR2, terwijl TLR4 een mindere rol speelt5.
De NF-κb/AP-1 reporter macrofaag cellijn (tabel met materialen) gebruikt in dit protocol is een handige methode voor het meten van relatieve NF-κb en AP-1 activiteit in macrofagen5,7,8. In combinatie met TLR-pathway-remmers is deze cellijn een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van TLR-activering en zijn rol in ontsteking als reactie op een verscheidenheid aan stimuli5,7,8. De reporter cellen zijn een gemodificeerde muis macrophage-achtige cellijn die stabiel kan produceren uitgescheiden embryonale alkalische fosfatase (SEAP) op NF-κB en AP-1 transcriptiefactor activering9. De colorimetrische enzymatische alkalische fosfatase assay (tabel met materialen) kan vervolgens worden gebruikt om relatieve hoeveelheden seap-expressie te kwantificeren als indirecte maatstaf van NF-κb/AP-1-activiteit. Omdat NF-κB en AP-1 stroomafwaarts liggen van veel cel signalerings trajecten, kunnen neutraliserende antilichamen en remmers die gericht zijn op specifieke Tlr’s (bijv. TLR2) of TLR-adapter moleculen (bijvoorbeeld MyD88) worden gebruikt om de rol van een specifiek traject te controleren. De in dit artikel beschreven methodologie biedt een eenvoudige en snelle benadering voor het beoordelen van de bijdrage van TLR-signalering in muriene macrofaag responsen op een verscheidenheid aan polymere oppervlakken met geadsorlageerde proteïne lagen die zowel bloed eiwitten als DAMPs bevatten als een in vitro model van geïmplanteerde biomaterialen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een primaire focus van ons lab is de gastheer reactie op solide biomateriaal weke delen implantaten, en in het bijzonder hoe de cellulaire schade opgelopen tijdens de implantatie procedure invloed op de reactie van de gastheer. Het hier gepresenteerde werk beschrijft voorbereidende experimenten met behulp van een verslaggever macrofaag cellijn en in vitro-gegenereerd vocht-bevattende cellulair lysaat, om de invloed te onderzoeken van moleculen die vrijkomen tijdens cellulaire schade (d.w.z. van de implantatie operatie) o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de operationele financiering van Canadian Institutes of Health Research project (PTJ 162251), Queen’s University Senate Advisory Research Committee en Infrastructure support van de Canadian Foundation for Innovation John Evan’s Leadership Fund (project 34137) en het Ontario Research Fund van het ministerie van onderzoek en innovatie (project 34137). L.A.M. werd gesteund door een Queen’s University R. Samuel McLaughlin Fellowship, een natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad van Canada Canadian Graduate beurs Master’s Award en een Ontario Graduate beurs. De auteurs willen Dr. Myron szewczuk bedanken voor zijn genereuze gave van de NF-κb/AP-1 reporter macrofaag Cell line en Drs. Michael Blennerhassett en Sandra lourenssen voor het gebruik van hun gel Imaging systeem en Plate Reader.
Materials
| Cell culture reagents | |||
| anti-mouse/human CD282 (TLR2) | Biolegend | 121802 | |
| CLI-095 (TLR4 inhibitor) | Invivogen | TLRL-CLI95 | |
| C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin | InnovativeResearch | IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml | Mouse plasma |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D6429-500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Fisher Scientific | 14190250 | No calcium, no magnesium |
| Fetal bovine serum (FBS), research grade | Wisent | 98150 | |
| LPS-EK | Invivogen | TLRL-EKLPS | Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 |
| NIH/3T3 fibroblasts | ATCC | CRL-1658 | |
| Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | Synthetic triacylated lipopeptide – TLR1/2 ligand |
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-100ML | |
| Plasmocin | Invivogen | ANT-MPP | Mycoplasma elimination reagent |
| RAW-Blue cells | Invivogen | raw-sp | NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line |
| Trypan blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE express enzyme (1X) | Fisher Scientific | 12604021 | animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme |
| Zeocin | Invivogen | ANT-ZN-1 | |
| Kits and assays | |||
| ELISA precoated plates, mouse IL-6 | Biolegend | B213022 | |
| ELISA precoated plates, mouse TNF-α | Biolegend | B220233 | |
| Endotoxin (Escherichia coli) – Control standard endotoxin (CSE) | Associates of Cape Cope Inc. | E0005-5 | Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay |
| LAL water, 100 mL | Associates of Cape Cope Inc. | WP1001 | Used with chromogenic endotoxin assay |
| Micro BCA protein assay | Fisher Scientific | PI23235 | |
| Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit | Associates of Cape Cope Inc. | C1500-5 | Chromogenic endotoxin assay reagent |
| QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium | Invivogen | rep-qb2 | Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity |
| Polymeric coating reagents | |||
| Chloroform, anhydrous | Sigma Aldrich | 288306-1L | |
| Ethyl alcohol anhydrous | Commercial Alcohols | P006EAAN | Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L |
| Straight tapered fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-113 | |
| Fluorinert FC-40 solvent | Sigma Aldrich | F9755-100ML | Fluorinated solvent for fPTFE |
| Cell culture grade water (endotoxin-free) | Fisher Scientific | SH30529LS | |
| Poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Sigma Aldrich | 182230-25G | |
| Sylgard 184 elastomer kit | Fisher Scientific | 50822180 | |
| Teflon-AF (fPTFE) | Sigma Aldrich | 469610-1G | Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene] |
| Consumables | |||
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Axygen microtubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-222-155 | |
| Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| Clear PS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-52 | |
| Clear TCPS 96-well plate | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| Clear TCPS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-1C | |
| Cover glasses, circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Falcon tissue culture treated flasks, T25 | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| sticky-Slide 8 Well | Ibidi | 80828 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue culture treated flasks, T150 | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
References
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 86-100 (2008).
- Anderson, J. M., Miller, K. M. Biomaterial biocompatibility and the macrophage. Biomaterials. 5 (1), 5-10 (1984).
- Collier, T. O., Anderson, J. M. Protein and surface effects on monocyte and macrophage adhesion, maturation, and survival. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (3), 487-496 (2002).
- Bianchi, M. E. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. Journal of Leukocyte Biology. 81 (1), 1-5 (2007).
- McKiel, L. A., Fitzpatrick, L. E. Toll-like Receptor 2-Dependent NF-κB/AP-1 Activation by Damage-Associated Molecular Patterns Adsorbed on Polymeric Surfaces. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3792-3801 (2018).
- Babensee, J. E. Interaction of dendritic cells with biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 101-108 (2008).
- Sintes, J., Romero, X., de Salort, J., Terhorst, C., Engel, P. Mouse CD84 is a pan-leukocyte cell-surface molecule that modulates LPS-induced cytokine secretion by macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 88 (4), 687-697 (2010).
- Tom, J. K., Mancini, R. J., Esser-Kahn, A. P. Covalent modification of cell surfaces with TLR agonists improves and directs immune stimulation. Chemical Communications. 49 (83), 9618-9620 (2013).
- Abdulkhalek, S., et al. Neu1 sialidase and matrix metalloproteinase-9 cross-talk is essential for toll-like receptor activation and cellular signaling. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36532-36549 (2011).
- Gorbet, M. B., Sefton, M. V. Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials. 26 (34), 6811-6817 (2005).
- Xing, Z., Pabst, M. J., Hasty, K. A., Smith, R. A. Accumulation of LPS by polyethylene particles decreases bone attachment to implants. Journal of Orthopaedic Research. 24 (5), 959-966 (2006).
- Ding, H., et al. Comparison of the cytotoxic and inflammatory responses of titanium particles with different methods for endotoxin removal in RAW264.7 macrophages. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 23 (4), 1055-1062 (2012).
- Hoogenboom, R., Becer, C. R., Guerrero-Sanchez, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Solubility and thermoresponsiveness of PMMA in alcohol-water solvent mixtures. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1173-1178 (2010).
- Efimenko, K., Wallace, W. E., Genzer, J. Surface modification of Sylgard-184 poly(dimethyl siloxane) networks by ultraviolet and ultraviolet/ozone treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 254 (2), 306-315 (2002).
- Godek, M. L., Sampson, J. A., Duchsherer, N. L., McElwee, Q., Grainger, D. W. Rho GTPase protein expression and activation in murine monocytes/macrophages is not modulated by model biomaterial surfaces in serum-containing in vitro cultures. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 17 (10), 1141-1158 (2006).
- Park, J. S., et al. Involvement of Toll-like Receptors 2 and 4 in Cellular Activation by High Mobility Group Box 1 Protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (9), 7370-7377 (2004).
- Ohashi, K., Burkart, V., Flohé, S., Kolb, H. Cutting Edge: Heat Shock Protein 60 Is a Putative Endogenous Ligand of the Toll-Like Receptor-4 Complex. The Journal of Immunology. 164 (2), 558-561 (2000).
- Wong, T., McGrath, J. A., Navsaria, H. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration. British Journal of Dermatology. 156 (6), 1149-1155 (2007).
- van Wachem, P. B., et al. The influence of protein adsorption on interactions of cultured human endothelial cells with polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 21 (6), 701-718 (1987).
- Miller, K. M., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage activation and interleukin 1 generation by biomedical polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 22 (8), 713-731 (1988).
- Bonfield, T. L., Colton, E., Anderson, J. M. Plasma protein adsorbed biomedical polymers: Activation of human monocytes and induction of interleukin 1. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (6), 535-548 (1989).
- González, O., Smith, R. L., Goodman, S. B. Effect of size, concentration, surface area, and volume of polymethylmethacrylate particles on human macrophages in vitro. Journal of Biomedical Materials Research. 30 (4), 463-473 (1996).
- Anderson, J. M., et al. Protein adsorption and macrophage activation on polydimethylsiloxane and silicone rubber. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 7 (2), 159-169 (1995).
- Lord, M. S., Foss, M., Besenbacher, F. Influence of nanoscale surface topography on protein adsorption and cellular response. Nano Today. 5 (1), 66-78 (2010).
- Chen, S., et al. Characterization of topographical effects on macrophage behavior in a foreign body response model. Biomaterials. 31 (13), 3479-3491 (2010).
- Shen, M., Horbett, T. A. The effects of surface chemistry and adsorbed proteins on monocyte/macrophage adhesion to chemically modified polystyrene surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 57 (3), 336-345 (2001).
- Love, R. J., Jones, K. S. The recognition of biomaterials: Pattern recognition of medical polymers and their adsorbed biomolecules. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (9), 2740-2752 (2013).
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Phenotypic expression in human monocyte-derived interleukin-4-induced foreign body giant cells and macrophages in vitro: Dependence on material surface properties. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1380-1390 (2015).
- Gambhir, V., et al. The TLR2 agonists lipoteichoic acid and Pam3CSK4 induce greater pro-inflammatory responses than inactivated Mycobacterium butyricum. Cellular Immunology. 280 (1), 101-107 (2012).
- Suzuki, O., Yagishita, H., Yamazaki, M., Aoba, T. Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Octacalcium Phosphate and its Hydrolyzates. Cells and Materials. 5 (1), 45-54 (1995).
- Johnston, R. L., Spalton, D. J., Hussain, A., Marshall, J. In vitro protein adsorption to 2 intraocular lens materials. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 25 (8), 1109-1115 (1999).
- Jin, J., Jiang, W., Yin, J., Ji, X., Stagnaro, P. Plasma proteins adsorption mechanism on polyethylene-grafted poly(ethylene glycol) surface by quartz crystal microbalance with dissipation. Langmuir. 29 (22), 6624-6633 (2013).
- Swartzlander, M. D., et al. Linking the foreign body response and protein adsorption to PEG-based hydrogels using proteomics. Biomaterials. 41, 26-36 (2015).
- Chamberlain, M. D., et al. Unbiased phosphoproteomic method identifies the initial effects of a methacrylic acid copolymer on macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (34), 10673-10678 (2015).
- Dillman, W. J., Miller, I. F. On the adsorption of serum proteins on polymer membrane surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 44 (2), 221-241 (1973).
- Ishihara, K., Ziats, N. P., Tierney, B. P., Nakabayashi, N., Anderson, J. M. Protein adsorption from human plasma is reduced on phospholipid polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (11), 1397-1407 (1991).
- Warkentin, P., Wälivaara, B., Lundström, I., Tengvall, P. Differential surface binding of albumin, immunoglobulin G and fibrinogen. Biomaterials. 15 (10), 786-795 (1994).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 33 (5), 443-454 (2010).
- Zhang, Y., Karki, R., Igwe, O. J. Toll-like receptor 4 signaling: A common pathway for interactions between prooxidants and extracellular disulfide high mobility group box 1 (HMGB1) protein-coupled activation. Biochemical Pharmacology. 98 (1), 132-143 (2015).
- Mizel, S. B., Honko, A. N., Moors, M. A., Smith, P. S., West, A. P. Induction of macrophage nitric oxide production by Gram-negative flagellin involves signaling via heteromeric Toll-like receptor 5/Toll-like receptor 4 complexes. Journal of Immunology. 170 (12), 6217-6223 (2003).
- Das, N., et al. HMGB1 Activates Proinflammatory Signaling via TLR5 Leading to Allodynia. Cell Reports. 17 (4), 1128-1140 (2016).
- Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 Receptor Differentially Couples to Distinct Release Pathways for IL-1β in Mouse Macrophage. The Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
- Tak, P. P., Firestein, G. S. NF-κB: A key role in inflammatory diseases. Journal of Clinical Investigation. 107 (1), 7-11 (2001).
- Ashkenazi, A., Dixit, V. M. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281 (5381), 1305-1308 (1998).
- Erridge, C. Endogenous ligands of TLR2 and TLR4: agonists or assistants. Journal of Leukocyte Biology. 87 (6), 989-999 (2010).
- Feng, Y., et al. A macrophage-activating, injectable hydrogel to sequester endogenous growth factors for in situ angiogenesis. Biomaterials. 134, 128-142 (2017).
- Lonez, C., et al. Cationic lipid nanocarriers activate Toll-like receptor 2 and NLRP3 inflammasome pathways. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 10 (4), 775-782 (2014).
