Un ensayo celular de reportero de macrófagos para examinar la señalización NF-kB/AP-1 mediada por receptores similares al peaje en capas de proteínas absorbentes en superficies poliméricas
Summary
Este protocolo proporciona a los investigadores un método rápido e indirecto para medir la actividad del factor de transcripción NF–B/AP-1 dependiente de TLR en una línea celular de macrófagomur en respuesta a una variedad de superficies poliméricas y capas de proteínas adsorbidas que modelan el microambiente de implantes de biomaterial.
Abstract
La persistente respuesta inflamatoria del huésped a un biomaterial implantado, conocido como reacción del cuerpo extraño, es un desafío significativo en el desarrollo e implementación de dispositivos biomédicos y construcciones de ingeniería de tejidos. Los macrófagos, una célula inmune innata, son actores clave en la reacción del cuerpo extraño porque permanecen en el sitio del implante durante la vida útil del dispositivo, y se estudian comúnmente para obtener una comprensión de esta respuesta perjudicial del huésped. Muchos investigadores de biomateriales han demostrado que las capas de proteínas adsorbidas en materiales implantados influyen en el comportamiento de los macrófagos y, posteriormente, afectan la respuesta del huésped. Los métodos de este artículo describen un modelo in vitro utilizando capas de proteínas adsorbidas que contienen moléculas de daño celular en superficies de biomaterial espolimérico para evaluar las respuestas de los macrófagos. Se utilizaron como método rápido para examinar indirectamente la actividad del factor de transcripción NF-B/AP-1 en respuesta a complejas capas de proteínas absorbentes que contienen proteínas sanguíneas y patrones moleculares asociados al daño, como modelo de las complejas capas de proteínas adsorbidas formadas en superficies biomateriales in vivo.
Introduction
La reacción del cuerpo extraño (FBR) es una respuesta crónica del huésped que puede afectar negativamente el rendimiento de un material o dispositivo implantado (por ejemplo, dispositivos de administración de medicamentos, biosensores), a través de la liberación persistente de mediadores inflamatorios y al impedir la integración entre el material implantado y el tejido circundante1. Esta respuesta inmune innata se inicia por el procedimiento de implantación y se caracteriza por la presencia a largo plazo de células inmunitarias innatas y la formación de cápsulas fibrosas alrededor del implante1. En el contexto de las respuestas materiales del huésped, las interacciones entre macrófagos y materiales tienen un impacto significativo en la progresión de la respuesta del huésped y el desarrollo de un FBR1. Los macrófagos son una población de células inmunitarias innatas diversas, reclutadas en el sitio del implante, ya sea de poblaciones de macrófagos residentes en tejidos o de la sangre como macrófagos derivados de monocitos. Comienzan a acumularse en el sitio del implante poco después de la implantación, y en cuestión de días se convierten en la población celular predominante en el microambiente del implante. Los macrófagos adherentes a los materiales, junto con las células gigantes de cuerpo extraño (FBGC) formadas a través de la fusión de macrófagos, pueden persistir en la superficie del material durante la vida útil del implante2,3. En consecuencia, los macrófagos se consideran actores clave en la respuesta del cuerpo extraño debido a sus funciones orquestando los pasos característicos de la FBR: respuesta inflamatoria aguda, remodelación tisular y formación de tejido fibroso1.
Los receptores similares a los peajes (TLR) son una familia de receptores de reconocimiento de patrones que son expresados por muchas células inmunitarias, incluyendo macrófagos, y se ha demostrado que juegan un papel importante en la inflamación y la cicatrización de heridas. Además de los ligandos derivados de patógenos, los TLR son capaces de unir moléculas endógenas, conocidas como patrones moleculares asociados al daño (DAPP), que se liberan durante la necrosis celular y activan las vías de señalización inflamatoria que resultan en la producción de citoquinas proinflamatorias4. Nosotros y otros hemos propuesto que el daño incurrido durante los procedimientos de implantación de biomateriales de tejido blando libere a los DAMPs, que luego se adsorbe a las superficies biomateriales además de las proteínas de la sangre y modulalas las interacciones entre células y materiales subsiguientes5,6. Cuando los macrófagos interactúan con la capa de proteína adsorbida en un implante, sus TDR de superficie pueden reconocer los DPR adsorbidas y activar cascadas de señalización proinflamatoria, lo que conduce a la activación del factor de transcripción NF-B y AP-1 y a la producción de citoquinas proinflamatorias. Hemos demostrado anteriormente que los macrófagos murinos han aumentado significativamente la actividad de NF-B/AP-1 y el factor de necrosis tumoral (TNF– secreción proinflamatoria de citoquinas) en respuesta a las capas de proteína adsorbida que contienen DAMP en una variedad de superficies poliméricas en comparación con superficies con suero o plasma adsorbida solamente (es decir, no hay DAPP presentes), y que esta respuesta está mediada en gran medida por TLR2, mientras que TLR4 desempeña un papel menor5.
La línea celular de macrófagos de reportero NF-B/AP-1utilizadaen este protocolo es un método conveniente para medir la actividad relativa NF–B y AP-1 en macrófagos5,7,8. En combinación con los inhibidores de la vía TLR, esta línea celular es una herramienta útil para investigar la activación de TLR y su papel en la inflamación en respuesta a una variedad de estímulos5,7,8. Las células reporteras son una línea celular modificada similar a un macróforo de ratón que puede producir establemente fosfatasa alcalina embrionaria secreta (SEAP) sobre la activación del factor de transcripción NF-B y AP-19. El ensayo fosfatasa alcalina colorimétrica enzimática(Tabla de materiales) se puede utilizar para cuantificar las cantidades relativas de expresión SEAP como una medida indirecta de la actividad NF-B/AP-1. Como NF-B y AP-1 son aguas abajo de muchas vías de señalización celular, se pueden utilizar anticuerpos e inhibidores neutralizantes dirigidos a TlR específicos (por ejemplo, TLR2) o moléculas de adaptador TLR (por ejemplo, MyD88) para verificar el papel de una vía específica. La metodología descrita en este artículo proporciona un enfoque sencillo y rápido para evaluar la contribución de la señalización TLR en las respuestas de macrófagos murinos a una variedad de superficies poliméricas con capas de proteínas adsorbidas que contienen proteínas de la sangre y DAPP como modelo in vitro de biomateriales implantados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un enfoque principal de nuestro laboratorio es la respuesta del huésped a los implantes de tejido blando biomaterial sólido, y en particular cómo el daño celular incurrido durante el procedimiento de implantación afecta la respuesta del huésped. El trabajo presentado aquí describe experimentos preliminares utilizando una línea celular de macrófagos de reportero y un lisato celular que contiene DAMP generado in vitro, para investigar la influencia de las moléculas liberadas durante el daño celular (es decir, de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen la financiación operativa de Canadian Institutes of Health Research Project (PTJ 162251), el Comité asesor de investigación del Senado de la Universidad de Queen y el apoyo a la infraestructura de la Fundación Canadiense para la Innovación del Fondo de Liderazgo john Evan (Proyecto 34137) y el Fondo de Investigación de Ontario del Ministerio de Investigación e Innovación (Proyecto 34137). L.A.M. fue apoyado por una beca R. Samuel McLaughlin de la Universidad de La Reina, un Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá Canadian Graduate Scholarship’s Award y una Beca de Posgrado de Ontario. Los autores quieren agradecer al Dr. Myron Szewczuk por su generoso don de la línea celular de los macrófagos de reportero NF-B/AP-1 y a los doctores Michael Blennerhassett y Sandra Lourenssen por el uso de su sistema de imágenes de gel y lector de placas.
Materials
| Cell culture reagents | |||
| anti-mouse/human CD282 (TLR2) | Biolegend | 121802 | |
| CLI-095 (TLR4 inhibitor) | Invivogen | TLRL-CLI95 | |
| C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin | InnovativeResearch | IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml | Mouse plasma |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D6429-500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Fisher Scientific | 14190250 | No calcium, no magnesium |
| Fetal bovine serum (FBS), research grade | Wisent | 98150 | |
| LPS-EK | Invivogen | TLRL-EKLPS | Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 |
| NIH/3T3 fibroblasts | ATCC | CRL-1658 | |
| Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | Synthetic triacylated lipopeptide – TLR1/2 ligand |
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-100ML | |
| Plasmocin | Invivogen | ANT-MPP | Mycoplasma elimination reagent |
| RAW-Blue cells | Invivogen | raw-sp | NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line |
| Trypan blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE express enzyme (1X) | Fisher Scientific | 12604021 | animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme |
| Zeocin | Invivogen | ANT-ZN-1 | |
| Kits and assays | |||
| ELISA precoated plates, mouse IL-6 | Biolegend | B213022 | |
| ELISA precoated plates, mouse TNF-α | Biolegend | B220233 | |
| Endotoxin (Escherichia coli) – Control standard endotoxin (CSE) | Associates of Cape Cope Inc. | E0005-5 | Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay |
| LAL water, 100 mL | Associates of Cape Cope Inc. | WP1001 | Used with chromogenic endotoxin assay |
| Micro BCA protein assay | Fisher Scientific | PI23235 | |
| Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit | Associates of Cape Cope Inc. | C1500-5 | Chromogenic endotoxin assay reagent |
| QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium | Invivogen | rep-qb2 | Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity |
| Polymeric coating reagents | |||
| Chloroform, anhydrous | Sigma Aldrich | 288306-1L | |
| Ethyl alcohol anhydrous | Commercial Alcohols | P006EAAN | Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L |
| Straight tapered fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-113 | |
| Fluorinert FC-40 solvent | Sigma Aldrich | F9755-100ML | Fluorinated solvent for fPTFE |
| Cell culture grade water (endotoxin-free) | Fisher Scientific | SH30529LS | |
| Poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Sigma Aldrich | 182230-25G | |
| Sylgard 184 elastomer kit | Fisher Scientific | 50822180 | |
| Teflon-AF (fPTFE) | Sigma Aldrich | 469610-1G | Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene] |
| Consumables | |||
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Axygen microtubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-222-155 | |
| Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| Clear PS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-52 | |
| Clear TCPS 96-well plate | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| Clear TCPS 48-well plate | Fisher Scientific | 08-772-1C | |
| Cover glasses, circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Falcon tissue culture treated flasks, T25 | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| sticky-Slide 8 Well | Ibidi | 80828 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue culture treated flasks, T150 | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
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